鼠疫菌毒力蛋白YopM參與調(diào)控NALP3炎癥小體的分子機(jī)制研究.pdf

1、鼠疫是一種發(fā)病急、傳播快、病死率高、傳染性強(qiáng)的自然疫源性烈性傳染病，是危害人類最嚴(yán)重的烈性傳染病之一，屬國(guó)際檢疫傳染病，在我國(guó)《傳染病防治法》中列為甲類傳染病之首。歷史上鼠疫有三次大流行，均導(dǎo)致超過一千萬人以上的死亡，被稱為黑死病。在自然界，鼠疫主要感染嚙齒類動(dòng)物，通過跳蚤叮咬傳染至人類。鼠疫的病原體是耶爾森氏菌。鼠疫菌侵入機(jī)體后，首先被局部淋巴組織中的吞噬細(xì)胞所吞噬，大部分的細(xì)菌被吞噬細(xì)胞殺死，但是仍有部分被巨噬細(xì)胞吞噬的鼠疫菌能通過

2、某些機(jī)制得以存活和繁殖，并最終裂解細(xì)胞釋放到機(jī)體微環(huán)境中。從巨噬細(xì)胞釋放出來的鼠疫菌可以沿淋巴流到達(dá)局部淋巴結(jié)，甚至并轉(zhuǎn)移至血液和全身臟器中，進(jìn)而形成高致死性的敗血癥型鼠疫和肺鼠疫。對(duì)鼠疫菌致病分子機(jī)制的研究將有助于鼠疫的防治。
　　 鼠疫菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)（TypeⅢsecrtionsystem，T3SS）是鼠疫菌致病的重要因素。T3SS系統(tǒng)是革蘭氏陰性菌中廣泛存在的重要毒力因子，主要包括裝置蛋白、毒力蛋白、伴侶蛋白和轉(zhuǎn)位子蛋白

3、。其中毒力蛋白通過裝置蛋白被分泌到細(xì)胞外或宿主細(xì)胞表面。甚至直接“注射”到宿主細(xì)胞中。鼠疫菌主要有6種效應(yīng)蛋白:YopH，YopE，YopT,YopJ/P,YpkA和YopM，這些效應(yīng)蛋白對(duì)鼠疫菌的毒力起到至關(guān)重要的作用。其中，YopM在感染宿主過程中尤為關(guān)鍵，當(dāng)YopM缺失突變，鼠疫茵的致病性大大降低。我們前期實(shí)驗(yàn)表明，YopM能夠促進(jìn)IL-1β分泌甚至“細(xì)胞焦亡”，并且通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，YopM可能是個(gè)新型的E3連接酶。然而，Yo

4、pM作為鼠疫菌內(nèi)非常重要的毒力因子，其宿主靶標(biāo)和致病具體機(jī)制的尚不清楚。因此本研究擬通過實(shí)驗(yàn)研究確定YopM的E3連接酶活性及其底物，進(jìn)一步研究YopM的E3連接酶活性對(duì)鼠疫菌致病性的影響。
　　 我們研究表明:YopM特異性靶向NALP3蛋白，與NALP3相互作用并介導(dǎo)NALP3發(fā)生K63位泛素化連接，從而調(diào)控NALP3炎癥小體的炎癥反應(yīng)。雖然炎癥反應(yīng)能夠抵御細(xì)菌和病毒感染，維持細(xì)胞的存活，起到保護(hù)宿主清除鼠疫菌等致病菌的入侵

5、，但是炎癥的過度激活，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞屏障破壞，細(xì)菌進(jìn)一步擴(kuò)散。因此，我們推測(cè)YopM可以調(diào)控炎癥小體組成蛋白NALP3蛋白穩(wěn)定性并對(duì)其進(jìn)行泛素化修飾作用，這是調(diào)控宿主抗病原菌應(yīng)答一種新的機(jī)制。進(jìn)一步研究表明:
　　 1、YopM在參與炎癥小體的調(diào)控中起到至關(guān)重要的作用:通過鼠疫菌感染小鼠骨髓巨噬細(xì)胞BMDM，發(fā)現(xiàn)野生型鼠疫菌導(dǎo)致procaspase-1激活并促進(jìn)IL-1β分泌，YopM缺失突變的菌株激活炎癥小體的功

6、能明顯減弱。
　　 2、YopM是個(gè)新型的E3連接酶:通過體內(nèi)和體外自身泛素實(shí)驗(yàn)，證實(shí)YopM具有E3連接酶活性。通過序列分析、構(gòu)建CA突變體，發(fā)現(xiàn)YopM通過其N端的第68位半胱氨酸發(fā)揮E3連接酶功能。
　　 3、YopM通過影響NALP3穩(wěn)定性調(diào)控炎癥小體的激活:通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)YopM能夠與NALP3相互作用，進(jìn)一步免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明YopM通過E3連接酶使NALP3發(fā)生K63位泛素化連接，增強(qiáng)NALP3的穩(wěn)定

7、性并延長(zhǎng)其半衰期。
　　 4、YopM調(diào)控NALP3炎癥小體介導(dǎo)的抗病原菌細(xì)胞應(yīng)答:通過鼠疫菌感染BMDC細(xì)胞并檢測(cè)其毒力，發(fā)現(xiàn)YopM缺失突變的鼠疫菌侵染巨噬細(xì)胞的毒力大大降低，YopMC68A回復(fù)突變株不能同YopM回復(fù)突變株一樣恢復(fù)其強(qiáng)毒力。
　　 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)YopM作為新型E3連接酶，通過其N端的68位半胱氨酸催化Nalp3發(fā)生K63-連接的泛素化修飾，并與NALP3發(fā)生相互作用，增強(qiáng)Nalp3穩(wěn)定性、