西格列汀對(duì)3T3-L1細(xì)胞NALP3炎癥復(fù)合體的作用及機(jī)制研究.pdf

1、2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)嚴(yán)重威脅著人類健康，然而T2DM的發(fā)病機(jī)制尚未明確。研究表明，以NALP3炎癥體為中心的慢性炎癥反應(yīng)參與2型糖尿病的發(fā)生。NALP3炎癥體是核苷酸結(jié)構(gòu)域樣受體(NALPs)家族成員，是新近發(fā)現(xiàn)的活化caspase-1、調(diào)控IL-1β成熟和分泌的分子平臺(tái);IL-1β是目前已知促炎活性的細(xì)胞因子之一，文獻(xiàn)提示其能夠促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)展。目前以干預(yù)代謝性炎癥通路、降低炎癥因

2、子水平為目標(biāo)的抗炎治療在T2DM的降糖治療仍處于起步階段。
　　本實(shí)驗(yàn)組的早期觀察研究發(fā)現(xiàn)，西格列汀可能對(duì)NALP3炎癥體具有一定抑制作用。本研究旨在本實(shí)驗(yàn)組已有的研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討西格列汀對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞內(nèi)NALP3炎癥體的抑制作用，尋找西格列汀可能存在的藥理新機(jī)制，為抗炎治療在T2DM的降糖治療提供理論依據(jù)。
　　方法:將3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，設(shè)定分組為空白對(duì)照組、西格列汀藥物處理組，分別設(shè)定濃度梯度及

3、時(shí)間梯度。待細(xì)胞密度＞90％后48h進(jìn)行誘導(dǎo)分化，同時(shí)按分組設(shè)定予以各組藥物作用。用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基上清IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α的濃度。用western blot方法測(cè)定細(xì)胞中NALP3復(fù)合體各組分蛋白的表達(dá)情況。用real-time PCR測(cè)定細(xì)胞中NALP3復(fù)合體各組分NALP3、ASC、caspase-1RNA表達(dá)情況

4、。用Western Blot方法測(cè)定細(xì)胞中NF-κB及IκBα蛋白表達(dá)水平情況。
　　此外將3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，設(shè)定分組為空白對(duì)照組、10nM西格列汀藥物處理組，10nM西格列汀+10nM Exendin9-39藥物處理組，10nM西格列汀+50nM Exendin9-39藥物處理組。待細(xì)胞密度＞90％后48h進(jìn)行誘導(dǎo)分化，同時(shí)按分組設(shè)定予以各組藥物作用。用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorb

5、ent assay，ELISA)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基上清IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α的濃度。
　　結(jié)果:
　　1.5-100nmol/L西格列汀能明顯抑制3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化期IL-1β、TNF-α、IL-18、IL-6分泌，呈劑量依賴關(guān)系。
　　2.10nmol/L西格列汀能明顯抑制3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化期IL-1β、TNF-α、IL-18、IL-6分泌，呈時(shí)間依賴關(guān)系。
　　3.5-100nm

6、ol/L西格列汀處理3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化期一定時(shí)間后，細(xì)胞內(nèi)NALP3炎癥體ASC、Caspase1組分表達(dá)減少，pro-caspase1組分表達(dá)增加。
　　4.10nmol/L西格列汀處理3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化期不同的時(shí)間均觀察到細(xì)胞內(nèi)NALP3炎癥體ASC、Caspase1組分表達(dá)減少，pro-caspase1組分增加。
　　5.5-100nmol/L西格列汀處理3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化期一定時(shí)間后，細(xì)胞內(nèi)NALP

7、3炎癥體ASC、Caspase1、NLRP3組分mRNA表達(dá)減少。
　　6.50nM Exendin9-39能拮抗10nM西格列汀對(duì)3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化期IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-18炎癥因子的抑制效應(yīng);10nM Exendin9-39能部分拮抗10nM西格列汀對(duì)3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化期炎癥因子了的抑制效應(yīng)。
　　7.10nmol/L西格列汀處理3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化期2天后觀察到細(xì)胞內(nèi)NF-κB組分p

8、65表達(dá)減少，IκBα蛋白表達(dá)增加。
　　結(jié)論:
　　西格列汀能夠抑制3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化期細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系和時(shí)間依賴關(guān)系;同時(shí)西格列汀能夠抑制3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化期NALP3炎癥體蛋白的表達(dá)，NALP3炎癥體各組分mRNA合成減少。我們的實(shí)驗(yàn)提示西格列汀可能依賴GLP-1通路，通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路抑制NALP3炎癥體，從而抑制炎性介質(zhì)IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α的分泌，