抗人死亡受體5單鏈抗體誘導(dǎo)結(jié)腸癌sw480細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景及目的:
　　結(jié)直腸癌是一種高發(fā)病率和高死亡率的癌癥,2000年WHO統(tǒng)計(jì)顯示,男性和女性結(jié)直腸癌的發(fā)病率為9.4％和10.0%,其中年齡是一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素,平均為67歲。在中國(guó),結(jié)直腸癌的發(fā)病率僅次于胃癌、食道癌,并隨著生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的改變,其發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)。目前,結(jié)腸癌的治療方法主要有手術(shù)、放化療及中醫(yī)藥治療,而常見(jiàn)化療藥物有5-氟尿嘧啶、絲裂霉素和環(huán)磷酰胺等,傳統(tǒng)的化療藥物吸收利用率低且易出現(xiàn)大的毒副

2、作用,人類正迫切要找到一種新的治療方法。現(xiàn)有研究顯示,腫瘤細(xì)胞存在死亡受體DRs(death receptors),而TNF超家族成員腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing Ligand)則可通過(guò)結(jié)合受體DR4(Death receptor4)及DR5(Death receptor5)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在本次實(shí)驗(yàn)中,我們通過(guò)構(gòu)建抗人DR5單鏈抗體(aDR5ScFv),探討其是

3、否能誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡及其凋亡的可能機(jī)制,為今后研究特異性抗腫瘤治療方法或研制免疫導(dǎo)向藥物奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建重組質(zhì)粒pEt22b+aDR5ScFv,轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliB12,后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)抗人DR5單鏈抗體(aDR5ScFv),再用凝膠電泳法分析aDR5ScFv的純度。2、在一定濃度的aDR5ScFv作用下,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)腸癌sw480細(xì)胞表面DR受體的表達(dá)情況。3、將a

4、DR5ScFv稀釋成7個(gè)濃度,分別作用于鼠結(jié)腸癌sw480細(xì)胞4h和12h,采用MTT法觀察aDR5ScFv抗體對(duì)結(jié)腸癌sw480細(xì)胞的毒性效應(yīng)。4、將2個(gè)不同濃度的aDR5ScFv分別作用于結(jié)腸癌sw480細(xì)胞12h后,收集細(xì)胞,加入凋亡檢測(cè)試劑,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。5、運(yùn)用Hoechst33342對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)變化。6、在aDR5ScFv抗體作用于鼠結(jié)腸癌sw480細(xì)胞后,收集細(xì)胞總蛋白,

5、運(yùn)用western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、實(shí)驗(yàn)組中結(jié)腸癌sw480細(xì)胞表面的DR5表達(dá)率為89.21%。
　　2、MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示,濃度為0.00219、0.004375、0.00875、0.0175、0.035、0.07、0.14mg/ml的aDR5ScFv分別作用于結(jié)腸癌sw480細(xì)胞4h和12h后的細(xì)胞抑制率(%)為18.3±1.3、22.1±1.5、32.4±1.3、

6、34.2±1.2、38±1.1、45.2±1.0、60.3±1.3和27.1±0.4、32.6±1.8、35.4±1.6、40.7±1.13、54.3±0.42、75±1.51、89±1.85,隨著抗體濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞抑制率明顯上升。
　　3、流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,濃度為0.004375mg/ml和0.035mg/ml的aDR5ScFv作用于結(jié)腸癌sw480細(xì)胞12h后,其細(xì)胞凋亡率分別為21.87%和42.3%。<

7、br>　　4、熒光顯微鏡觀察顯示,相對(duì)于對(duì)照組(細(xì)胞形態(tài)呈圓形,無(wú)核固縮,無(wú)細(xì)胞凋亡)而言,實(shí)驗(yàn)組(aDR5ScFv作用于結(jié)腸癌sw480細(xì)胞后)細(xì)胞在200倍視野下可見(jiàn)中晚期凋亡,在400倍視野下中晚期凋亡細(xì)胞中,可見(jiàn)核固縮碎裂。
　　5、western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,相對(duì)于對(duì)照組而言,實(shí)驗(yàn)組中促進(jìn)細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白active-caspase3、pro-caspase3、8、bid、jun、均表達(dá)上調(diào)。同時(shí),抑

8、制細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白erk、akt、xiap表達(dá)下調(diào),而tipe則上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1、結(jié)腸癌sw480細(xì)胞的DR表達(dá)率高,非常適合用于研究新型抗腫瘤藥物。
　　2、抗人DR5單鏈抗體(aDR5ScFv)明顯促進(jìn)結(jié)腸癌sw480細(xì)胞的凋亡,是尋找抗腫瘤治療的一個(gè)重要方面。
　　3、抗人DR5單鏈抗體(aDR5ScFv)促進(jìn)結(jié)腸癌sw480細(xì)胞凋亡可能與caspases、bid、erk等相關(guān)調(diào)控因子通路密切相