死亡受體5在結(jié)腸癌組織的表達(dá)及抗死亡受體5新型人源抗體的篩選和鑒定.pdf

1、背景：近年來，罹患結(jié)腸癌的患者越來越多。雖然目前臨床診療技術(shù)逐步提高，手術(shù)方式日趨完善，化療、放療等輔助綜合手段不斷發(fā)展，但結(jié)腸癌的治愈率和術(shù)后5年生存率并沒有得到顯著的提高。近些年來，腫瘤生物免疫療法受到大家越來越多的關(guān)注，其具有靶向性、高效性及低毒性等優(yōu)勢(shì)，不久的將來有可能成為對(duì)抗腫瘤的一把新利器，在治療中占據(jù)主導(dǎo)地位。死亡受體5（death receptor5，DR5）屬于腫瘤壞死因子受體(Tumor Necrosis Facto

2、r receptor，TNFR)超家族成員，主要分布于多種腫瘤細(xì)胞的表面，在正常細(xì)胞很少或幾乎不表達(dá)，當(dāng)DR5與其配體腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）結(jié)合后，激活caspase-3，特異性誘導(dǎo)敏感腫瘤細(xì)胞凋亡，這些特性使得DR5成為腫瘤生物治療的重要靶點(diǎn)。
　　噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)是20世紀(jì)90年代建立的一種制備人

3、源抗體的新技術(shù)。該技術(shù)繞過了以往單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)研制過程中必經(jīng)的雜交瘤途徑，甚至不需要經(jīng)過免疫。隨著雅培公司運(yùn)用噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)獲得的治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的全人源抗體Humira等進(jìn)入市場(chǎng)，噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)已成為研發(fā)治療性抗體的重要平臺(tái)。
　　目的：免疫組織化學(xué)法探究DR5在正常結(jié)腸、結(jié)腸管狀腺瘤以及結(jié)腸管狀腺癌三者間的表達(dá)情況有無差異;在結(jié)腸管狀腺癌中的表達(dá)是否與性別、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋

4、巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理大體分型、組織學(xué)分型及TNM臨床預(yù)后分期有關(guān)。初步判斷DR5能否作為腫瘤生物免疫治療中一個(gè)潛在的良好靶點(diǎn)，是否與腫瘤的臨床病理特征相關(guān)，為未來腫瘤的個(gè)體化治療及相關(guān)抗體藥物的臨床試驗(yàn)提供初步線索。然后從大容量天然噬菌體抗體庫(kù)中篩選抗DR5人源單鏈抗體(single chain Fv，scFv)并對(duì)其抗原結(jié)合活性進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步研究該抗體抗腫瘤的生物免疫學(xué)作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：用HE染色確認(rèn)實(shí)驗(yàn)樣本的病理學(xué)診

5、斷，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)DR5在正常結(jié)腸、結(jié)腸管狀腺瘤、結(jié)腸管狀腺癌以及結(jié)腸黏液腺癌中的表達(dá)情況;以前期真核表達(dá)純化的DR5-Fc蛋白包被篩選管，從自主構(gòu)建的大容量天然噬菌體抗體庫(kù)中，通過4輪篩選過程獲得噬菌體抗體，通過異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)獲得可溶性抗體，采用ELISA、免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫組織化學(xué)法鑒定抗體的抗原結(jié)合活性，DNA指紋

6、圖譜分析和序列測(cè)定確定其抗體類型。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.DR5在正常結(jié)腸、結(jié)腸管狀腺瘤及結(jié)腸管狀腺癌組織中的表達(dá)結(jié)腸正常組織中DR5的表達(dá)較結(jié)腸管狀腺瘤和結(jié)腸管狀腺癌均低，結(jié)腸管狀腺癌以及結(jié)腸管狀腺瘤組織中DR5相對(duì)高表達(dá)，但管狀腺癌與腺瘤之間DR5的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.DR5的表達(dá)水平與結(jié)腸管狀腺癌臨床病理特征的關(guān)系DR5在結(jié)腸管狀腺癌組織中的表達(dá)情況與患者的性別、腫瘤的大小、大體類型、組織學(xué)分型、浸潤(rùn)

7、分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯關(guān)系，僅僅與腫瘤的TNM臨床預(yù)后分期有關(guān)，DR5在結(jié)腸管狀腺癌晚期及終末期（Ⅲ、Ⅳ期）中的表達(dá)較早中期(Ⅰ、Ⅱ期)有明顯的下降趨勢(shì)。
　　3.利用大型天然噬菌體抗體庫(kù)篩選抗死亡受體5人源抗體經(jīng)過4輪篩選，噬菌體抗體得到明顯富集。從后兩輪庫(kù)中隨機(jī)挑選80個(gè)單菌落，噬菌體誘導(dǎo)表達(dá)。ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示有59個(gè)與DR5-Fc有結(jié)合活性，陽性率為73.6％，其中特異性結(jié)合的克隆為46個(gè)。46個(gè)噬菌體陽性克隆

8、制備可溶性scFv，其中有26個(gè)克隆與DR5-Fc特異性結(jié)合。
　　4.對(duì)陽性克隆的進(jìn)一步分析26個(gè)陽性克隆的DNA MvaⅡ酶切后聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示，共獲得了4種不同的指紋圖譜。對(duì)4種不同陽性克隆測(cè)序結(jié)果分析，4個(gè)抗體基因來源于不同的胚系，其中輕鏈可變區(qū)同屬于VK3、VL1、VL2亞群，而重鏈可變區(qū)基因分屬VH1，VH3亞群。
　　5.細(xì)胞ELISA、免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫組織化學(xué)鑒定篩選抗體的抗原結(jié)合活性4種陽性克隆

9、的噬菌體抗體及可溶性抗體均能與細(xì)胞中表達(dá)的DR5蛋白特異性結(jié)合。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　1.DR5在正常結(jié)腸組織中低表達(dá)，在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，兩者的表達(dá)情況有顯著性差異性，提示DR5具備成為腫瘤未來生物免疫治療中一個(gè)潛在的良好靶點(diǎn)。
　　2.DR5在結(jié)腸管狀腺瘤中的表達(dá)較正常結(jié)腸組織有明顯升高的趨勢(shì)，提示DR5在癌前病變形成早期可能發(fā)揮著一定的作用。
　　3.DR5在結(jié)腸管狀腺癌早中期有著高表達(dá)，而在晚期及終末期