細(xì)絲蛋白A對人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株體外侵襲能力影響的研究.pdf

1、背景：結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma,CRC)是發(fā)生于結(jié)腸部位常見的消化道惡性腫瘤,CRC的病死率居癌癥病死率的第2位,在全世界范圍居第4位,好發(fā)于直腸及直腸與乙狀結(jié)腸交界處,約占65％,發(fā)病大多在40歲以后,男女比例為2～3:1。以40～50歲年齡組發(fā)病率最高。各地資料顯示,隨著人們生活水平的提高,飲食結(jié)構(gòu)的改變,其發(fā)病率正呈逐年上升趨勢[1]。且療效并不樂觀,近年來的結(jié)直腸癌5年生存率徘徊在50％-60％[2];

2、此外,結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌患者愈后不良的主要原因。因此,急待進(jìn)行與結(jié)腸癌相關(guān)的基礎(chǔ)研究為臨床診斷及治療提供指導(dǎo)。既往研究表明,細(xì)絲蛋白A(FLNa)與乳腺癌、前列腺癌、惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3],近年來,隨著對FLNa研究的不斷深入,認(rèn)為FLNa在結(jié)直腸癌的形成和發(fā)展中具有重要作用,有望成為新的檢測結(jié)直腸腺癌發(fā)生、形成、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物,而且對其抑癌機(jī)制的深入研究還可為臨床建立個(gè)體化、靶向化治療結(jié)直腸癌提供理論依

3、據(jù)。
　　 我們在前期研究中,對60例標(biāo)本采用免疫組織化學(xué)SP法,以人子宮組織著色作為陽性對照,以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗進(jìn)行染色作為陰性對照,結(jié)果證明結(jié)腸癌組織的FLNa蛋白表達(dá)低于正常組,說明FLNa蛋白可抑制結(jié)直腸腺癌的發(fā)生,在病理狀態(tài)下呈低表達(dá),并且FLNa蛋白其表達(dá)水平與結(jié)直腸腫瘤的侵襲力呈負(fù)相關(guān),對腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移具有明顯阻遏作用,因此有望成為結(jié)直腸腫瘤診斷,治療、預(yù)后的新指標(biāo)[4]。此外,我們在前期研究中,通

4、過對60例結(jié)腸腺癌患者手術(shù)切除的結(jié)直腸腺癌組織和正常結(jié)直腸組織進(jìn)行RT-PCR法和Westem印跡法檢測,發(fā)現(xiàn)MMP-9在結(jié)直腸腺癌組織中的陽性表達(dá)率高于正常結(jié)直腸組織,并且在癌組織中的表達(dá)水平與FLNa蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),其表達(dá)與腫瘤的TNM分期,肝轉(zhuǎn)移,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腸壁浸潤深度也具有相關(guān)性[5]。本組實(shí)驗(yàn)將通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染、RT-PCR和Western blot檢測、MTT試驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室和Matrigel侵襲模

5、型進(jìn)一步探討FLNa對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖和移行的影響,并初步探討其抑癌機(jī)制,以期尋找診斷及治療結(jié)直腸癌的新方法。
　　 目的:
　　 研究細(xì)絲蛋白A(FLNa)對人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移行為的影響,并初步探討其抑癌的機(jī)制。
　　 方法:
　　 1：對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480進(jìn)行體外培養(yǎng)。
　　 2：本試驗(yàn)將FLNa基因質(zhì)粒載體pcDNA3.1/V5-His-TOPO/FLNa,以脂

6、質(zhì)體介導(dǎo)方式轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞。經(jīng)G418篩選,獲得FLNa基因穩(wěn)定表達(dá)的SW480/FLNa細(xì)胞,同時(shí),以不含F(xiàn)LNa基因質(zhì)粒載體pcDNA3.1/V5-His-TOPO質(zhì)粒作為空載體轉(zhuǎn)染對照組細(xì)胞。
　　 3：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western blot檢測3組細(xì)胞中FLNa基因?qū)?未轉(zhuǎn)染組野生型細(xì)胞(SW480)、轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞(SW480/pcDNA3.1)和轉(zhuǎn)染FLNa cDNA組SW480細(xì)胞(S

7、W480/FLNa)。
　　 4：采用MTT試驗(yàn)法檢測細(xì)胞的增殖能力并繪制細(xì)胞生長曲線,檢測細(xì)胞的存活和生長。
　　 5：依據(jù)劃痕損傷實(shí)驗(yàn)、Transwell小室和Matrigel侵襲模型評價(jià)FLNa抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。
　　 結(jié)果:
　　 1：在SW480細(xì)胞中,FLNa的表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-His-TOPO/FLNa獲得穩(wěn)定表達(dá)。
　　 2：SW480/FLN

8、a細(xì)胞中FLNa的mRNA的表達(dá)水平均較野生型SW480細(xì)胞高,分別為(1.27±0.03)vs(0.14±0.02),P＜0.01。
　　 3：SW480/FLNa細(xì)胞中FLNa蛋白的表達(dá)水平均較野生型SW480細(xì)胞高,分別為(1.18±0.03)vs(0.25±0.02),P＜0.05。
　　 4：MTT試驗(yàn)法檢測3組細(xì)胞(SW480、SW480/pcDNA3.1和SW480/FLNa)細(xì)胞生長曲線基本重疊,增殖能力

9、無差異。
　　 5：劃痕損傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:SW480組向劃痕處的遷移速度明顯快于SW480/FLNa組,而SW480與SW480/pcDNA3.1組間的遷移速度差異不明顯。
　　 6：Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)表明,SW480/FLNa組較SW480組穿膜/膠數(shù)量明顯減少(P＜0.05);SW480/pcDNA3.1組較SW480組穿膜/膠數(shù)量無差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:<