人清道夫受體AⅡ（SR-AⅡ）胞外部分在畢赤酵母的分泌表達(dá)及其拮抗劑篩選模型的構(gòu)建研究.pdf

1、在現(xiàn)代社會(huì)各種疾病中,心血管疾病的發(fā)病率和死亡率均居前列,動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是其主要病理基礎(chǔ).巨噬細(xì)胞上清道夫受體A(Macrophage Scavenger Receptor A,SR-A,亦被稱為MSR1)是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的重要參與者,可無(wú)限制攝取修飾低密度脂蛋白(modified low densitylipoprotein,mLDL),其攝取不存在負(fù)反饋機(jī)制,形成泡沫細(xì)胞,最終出現(xiàn)動(dòng)

2、脈粥樣硬化病灶.因此SR-A被認(rèn)為是發(fā)現(xiàn)新型心血管藥物的潛在靶位,抑制SR-A活性的化合物有望成為治療動(dòng)脈粥樣硬化的候選藥物.使用200 nM PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞4天,THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞,提取其總RNA.應(yīng)用兩步法RT-PCR擴(kuò)增得到編碼人Ⅱ型SR-A胞外部分(shSR-AⅡ)的cDNA片段,克隆至pGEM-T載體,測(cè)序結(jié)果表明DNA序列與文獻(xiàn)報(bào)道一致.將此片段克隆至巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)分泌表

3、達(dá)載體pPIC9K中,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒p9K-shSR-AⅡ.U937泡沫細(xì)胞模型進(jìn)一步表明shSR-AⅡ可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合oxLDL阻止巨噬細(xì)胞攝取oxLDL,從而抑制泡沫細(xì)胞形成,為以shSR-AⅡ?yàn)榘悬c(diǎn)建立抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物篩選模型奠定了基礎(chǔ).同時(shí)初步研究了重組菌株在不同發(fā)酵條件下的分泌表達(dá)情況.以受體-配基競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的原理為基礎(chǔ),通過(guò)對(duì)各種條件的優(yōu)化,包括采用硫酸銨分級(jí)沉淀方法,初步分離純化shSR-AⅡ;配基oxLDL的包被液等

4、,以重組shSR-AⅡ建立了SR-A拮抗劑篩選模型.應(yīng)用模型對(duì)560個(gè)化合物、220個(gè)微生物發(fā)酵液及320個(gè)微生物發(fā)酵液丙酮提取物進(jìn)行了初步篩選,初篩陽(yáng)性率為1.0%.對(duì)初篩陽(yáng)性化合物進(jìn)行了進(jìn)一步篩選,得到3個(gè)陽(yáng)性化合物,具有濃度依賴抑制效應(yīng),U937泡沫細(xì)胞模型顯示其中2個(gè)陽(yáng)性化合物可明顯抑制泡沫細(xì)胞形成.本研究首次利用巴斯德畢赤酵母分泌表達(dá)shSR-AⅡ;并以受體-配基競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合為基礎(chǔ),利用重組shSR-AⅡ建立了拮抗劑高通量篩選模