豬A類清道夫受體SRA和MARCO的克隆、表達(dá)及其介導(dǎo)對(duì)病原菌吞噬功能的研究.pdf

1、清道夫受體，作為一類先天性免疫受體，在宿主先天性防御中起著重要的作用。然而，到目前為止，對(duì)豬清道夫受體的研究還非常有限。
　　目的：為了深入了解豬清道夫受體SRA和MARCO的生物學(xué)特性，揭示SRA和MARCO在免疫中的作用，本文以豬A類清道夫受體SRA和MARCO為研究對(duì)象，利用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)受體的胞外區(qū)域進(jìn)行表達(dá)，制備純化的重組蛋白，以重組蛋白為免疫原，制備多抗血清，驗(yàn)證多抗血清的特異性。此外，從臨床發(fā)病豬的肺部分離細(xì)菌，構(gòu)建

2、豬SRA或MARCO的穩(wěn)定細(xì)胞系，檢測(cè)SRA和MARCO介導(dǎo)對(duì)細(xì)菌的吞噬功能，揭示其生物學(xué)功能。
　　材料與方法：
　?、儇iSRA和MARCO的分子克隆、表達(dá)、純化及其抗體的制備：根據(jù)GenBankSRA（NM_001243874）和MARCO（JQ25702.1）的全基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用豬肺組織擴(kuò)增SRA和MARCO編碼序列片段，克隆至載體pMD18-T中，測(cè)序驗(yàn)證擴(kuò)增序列的正確性。選取SRA胞外區(qū)基因片段（711bp

3、）和MARCO胞外區(qū)基因片段（709bp），利用PCR技術(shù)獲得目的片段，分別克隆入原核表達(dá)載體pET-28a中，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET-SRA-c和pET-MARCO-c。利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白rSRA-c（約32kDa）和rMARCO-c（約31kDa），以親和層析技術(shù)獲得純化的rSRA-c和rMARCO-c。分別利用純化的rSRA-c和rMARCO-c為免疫原，免疫BALB/c小鼠（100ug/小鼠），制備多抗血清。

4、>　?、赟RA和MARCO的真核表達(dá)載體及其穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建：將編碼序列分別克隆入PCDNA3.O載體中，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，將真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中，通過(guò)96孔板細(xì)胞傳代及G418的藥物篩選構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)豬SRA或MARCO的CHO細(xì)胞的細(xì)胞系，通過(guò)RT-PCR和Westernblot對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證。
　?、跾RA和MARCO介導(dǎo)對(duì)細(xì)菌吞噬功能的分析：對(duì)臨床發(fā)病豬進(jìn)行解剖，并從肺部分離細(xì)菌并用FITC進(jìn)行標(biāo)記，將標(biāo)記好的細(xì)

5、菌與構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞系相互作用，從而對(duì)SRA和MARCO的功能進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　?、贁U(kuò)增結(jié)果顯示SRA和MARCO的片段大小分別為1341bp和1188bp，與預(yù)期結(jié)果一致，測(cè)序結(jié)果與原編碼序列相同，表明擴(kuò)增的序列正確。原核質(zhì)粒PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示SRA和MARCO的片段大小分別為711bp和709bp，與目的片段大小一致。測(cè)序結(jié)果與選擇的胞外段序列一致，表明原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。經(jīng)Westernblot分析，SRA和M

6、ARCO分別在32kDa和31kD左右處出現(xiàn)了條帶，與目的片段大小相同，表明實(shí)驗(yàn)中制備的多抗血清可以識(shí)別rSRA-c（約32kDa）和rMARCO-c（約31kDa），具有很好的免疫原性。
　?、谡婧速|(zhì)粒PCR結(jié)果中SRA和MARCO的大小分別為1341bp和1188bp，與編碼序列大小一致，測(cè)序結(jié)果與編碼序列相同，表明真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。RT-PCR結(jié)果顯示SRA細(xì)胞系出現(xiàn)了大小為1341bp的條帶，與SRA的編碼序列大小相同

7、，MARCO細(xì)胞系中出現(xiàn)了片段大小為1188bp的條帶，與MARCO的編碼序列大小相同。細(xì)胞系蛋白的Westernblot結(jié)果顯示SRA的陽(yáng)性克隆細(xì)胞蛋白樣在55kD處出現(xiàn)了目的條帶，MARCO的陽(yáng)性克隆細(xì)胞蛋白樣在小于55kD處出現(xiàn)了目的條帶，表明穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功。
　?、蹚呐R床發(fā)病豬的肺中分離獲得了胸膜肺炎放線桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及化膿鏈球菌。經(jīng)對(duì)豬SRA和MARCO介導(dǎo)對(duì)細(xì)菌吞噬功能的分析，表明豬SRA和MARC