商陸抗病毒蛋白抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的研究.pdf

1、第一部分天然PAP-S的制備及其毒性研究
　　 目的：從美洲商陸種子中提取天然PAP-S，研究其對(duì)小鼠的急性及亞急性毒性。
　　 方法：采集美洲商陸種子，粉碎后加蒸餾水?dāng)嚢桦x心。上清液通過酸堿柱CM-Sephadex C-50分離酸性及堿性蛋白，堿性蛋白通過分子篩Sehpadex G-50 柱收集第一洗脫峰，濃縮后通過酸堿柱CM-Sephadex C-52 再次分離酸堿性蛋白，收集第二洗脫峰。SDS-PAGE 檢測(cè)分子量

2、，BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將80只昆明小鼠隨機(jī)分為8組，單次腹腔注射PAP-S，每組濃度分別為0.5、0.7、1、1.4、2、2.8、4、5.6mg/kg，觀察注射后14天內(nèi)小鼠的健康狀況及死亡率。40只昆明小鼠隨機(jī)分為4組，連續(xù)14天腹腔注射PAP-S，濃度分別為0、0.125、0.25、0.5mg/kg，停藥一天后采血檢測(cè)血清ALT、BUN 水平，取肝、腎組織做HE 染色。
　　 結(jié)果：洗脫后得到分子量約為30KD的單一條

3、帶，凍干后得到約200mg 粉末。取1mg 粉末溶于1ml 生理鹽水，BCA 測(cè)得蛋白濃度為0.6mg/ml。小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)顯示3天和14天時(shí)LD50分別為2.41和1.75mg/kg。亞急性毒性試驗(yàn)顯示，高濃度PAP-S組血清ALT 水平較陰性對(duì)照組輕度升高，但各組間BUN 水平無顯著性差異。HE 染色未見明顯病理變化。
　　 結(jié)論：成功制備了天然PAP-S。低濃度PAP-S 無明顯肝腎毒性。
　　 第二部分天然P

4、AP-S 體內(nèi)抑制HBV 復(fù)制的研究
　　 目的：探討天然PAP-S在HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠模型體內(nèi)抗HBV的效果。
　　 方法：給藥前，將24只HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠按照血清HBV DNA和HBsAg 水平配對(duì)，分為陰性對(duì)照組、拉米夫定組、PAP-S 0.125mg/kg 及0.25mg/kg組。持續(xù)給藥45天，于給藥第15、30、45天及停藥15天后自眼眶靜脈叢采血，熒光定量PCR法檢測(cè)小鼠血清中HBV DNA含量，ELIS

5、A 法檢測(cè)血清HBsAg 水平；取肝、腎組織，行HE 染色觀察給藥后小鼠肝、腎組織的病理變化，免疫組化染色計(jì)算肝臟HBsAg 陽性細(xì)胞的數(shù)量，real time RT-PCR測(cè)肝組織中HBV 復(fù)制中間體mRNA 含量。
　　 結(jié)果：與生理鹽水組相比，45天時(shí)拉米夫定組、PAP-S 0.125mg/kg、0.25mg/kg組對(duì)血清HBV DNA的抑制率分別為75.7％、68.9％、78.7％；對(duì)HBsAg的抑制率分別為29.7％、

6、23.3％、36％。各組肝腎組織HE 染色均未見明顯病理變化。免疫組化染色顯示PAP-S組小鼠肝臟組織中HBsAg 陽性細(xì)胞數(shù)量較生理鹽水組減少。RT-PCR結(jié)果顯示天然PAP-S組HBV mRNA 水平被抑制。
　　 結(jié)論：0.125及0.25mg/kg天然PAP-S在慢性乙肝病毒感染小鼠模型中對(duì)HBVDNA、HBsAg、HBV mRNA 有抑制作用。
　　 第三部分全長(zhǎng)及不同片段缺失型PAP基因及與HBV 核心蛋白融

7、合原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白純化
　　 目的：構(gòu)建全長(zhǎng)及不同片段缺失型PAP基因原核表達(dá)質(zhì)粒及與HBV 核心蛋白融合的PAP 原核表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行蛋白純化。
　　 方法：以PGEM-PAP 質(zhì)粒為模板設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增得到全長(zhǎng)及不同片段缺失型PAP基因，經(jīng)酶切、連接后測(cè)序確認(rèn)。以已測(cè)序的全長(zhǎng)及不同片段缺失型PAP 質(zhì)粒及HBc 質(zhì)粒為模板設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增PAP-HBc 融合基因，與PMD-18T 載體連接并轉(zhuǎn)化，經(jīng)酶

8、切鑒定及DNA序列檢測(cè)均證實(shí)為目標(biāo)序列。將原核載體pET-28a與構(gòu)建好的克隆用BamH I和Hind Ⅲ雙酶切，連接酶切產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序證實(shí)得到pET-28a-PAP-HBc 原核質(zhì)粒。將全長(zhǎng)PAP、全長(zhǎng)PAP-HBc 融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)后經(jīng)鎳離子親和層析柱分離純化，得到目的蛋白。
　　 結(jié)果：構(gòu)建的全長(zhǎng)及不同片段缺失型PAP基因的原核表達(dá)質(zhì)粒、PAP-HBc 融合基因原

9、核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)雙酶切及測(cè)序，證實(shí)各基因正確地插入到載體中，且讀碼框正確。誘導(dǎo)分離純化得到的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 檢測(cè)證實(shí)為目的蛋白。
　　 結(jié)論：成功地構(gòu)建了全長(zhǎng)和不同片段缺失型PAP基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。并純化出部分已構(gòu)建質(zhì)粒的蛋白。
　　 第四部分全長(zhǎng)及HBc 融合PAP基因原核表達(dá)蛋白體內(nèi)抗HBV的研究
　　 目的：觀察PAP12 及PAP12-HBc 融合蛋白在慢性乙肝病毒感染的小鼠體內(nèi)對(duì)HBV的抑制作用

10、。
　　 方法：給藥前，將24只HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠按照血清HBV DNA和HBsAg 水平配對(duì)，分為陰性對(duì)照組、拉米夫定組、PAP12組（0.125mg/kg）及PAP12-HBc 融合蛋白組（0.125mg/kg）。持續(xù)給藥45天，于給藥第15、30、45天及停藥15天后自眼眶靜脈叢采血，熒光定量PCR法檢測(cè)小鼠血清中HBV DNA含量，ELISA 法檢測(cè)血清HBsAg 水平；取小鼠肝、腎組織，行HE 染色觀察給藥后肝、腎組織

11、的病理變化，免疫組化染色計(jì)算肝臟HBsAg 陽性細(xì)胞的數(shù)量，real time RT-PCR測(cè)肝組織中HBV 復(fù)制中間體mRNA 水平。
　　 結(jié)果：與生理鹽水組相比，45天時(shí)PAP12組、PAP12-HBc 融合蛋白組對(duì)血清HBVDNA的抑制率分別為73％、77％；對(duì)HBsAg的抑制率分別為24.7％、27.2％。各組HE 染色均未見肝腎組織有明顯病理變化。免疫組化染色顯示PAP12組及PAP12-HBc 融合蛋白組小鼠肝臟中