商陸抗病毒蛋白基因（PAP）轉(zhuǎn)化煙草的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將商陸抗病毒蛋白(Pokeweedantiviralprotein，pAp)基因?qū)霟煵?，用捕獲pBinARpap質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404與煙草葉片外植體共培養(yǎng)，并在附加30mg/LKan的MS＋0.1mg/LIAA＋1.5mg/LBA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)植株分化，生芽后在附加30mg/LKan+O.1mg/LNAA的MS培養(yǎng)基上生根，實(shí)現(xiàn)再生植株。經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)、PCR-Southern檢測(cè)、RT-PCR檢測(cè)

2、，綜合抗TMV病毒試驗(yàn)結(jié)果，獲得能夠抵抗病毒侵染的工程植株.主要結(jié)果如下： 1.通過(guò)根癌農(nóng)桿菌葉盤轉(zhuǎn)化法，用含pBinARpap質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404侵染煙草K326，同時(shí)選擇了合適的Kan濃度對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)的外植體進(jìn)行篩選，經(jīng)共培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)，生根培養(yǎng)，最終得到抗性植株，分化出苗，獲得了45株抗卡那霉索的煙草植株，并全部移栽成活。 2.提取抗性植株葉片的基因組DNA，用設(shè)計(jì)的引物對(duì)45株植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果只有一株檢

3、測(cè)到大小1000bp的目的片段。為證實(shí)擴(kuò)增條帶為目的產(chǎn)物，進(jìn)行PCR-Southern檢測(cè)，將PCR電泳凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，然后用地高辛(DIG)標(biāo)記的PAPDNA探針進(jìn)行雜交分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)探針與陽(yáng)性植株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生了強(qiáng)烈的雜交反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了PCR擴(kuò)增片段的確為PAP基因，雜交結(jié)果證明PAP外源基因已整合進(jìn)煙草細(xì)胞核基因組中。 3.Trizol法提取陽(yáng)性植株的RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)，質(zhì)粒DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，PCR