對(duì)蝦抗病毒相關(guān)蛋白的分子克隆與功能研究.pdf

1、對(duì)蝦的養(yǎng)殖是我國沿海地區(qū)重要的水產(chǎn)支柱產(chǎn)業(yè)。但是白斑病毒(white spotsyndrome virus,WSSV)等病毒使對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)遭受了極大的損失。因此,研究對(duì)蝦的抗病毒先天免疫防御機(jī)制,對(duì)于預(yù)防和控制對(duì)蝦疾病具有重要意義。
　　 1.對(duì)蝦TRBP和eIF6之間存在直接的相互作用,并在對(duì)蝦抗病毒RNAi途徑中起作用
　　 HIV轉(zhuǎn)錄激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白(Trans-activation response RNA-

2、bindingprotein,TRBP)是一種多功能蛋白,在多種生命進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。我們從中國明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)中克隆得到三個(gè)TRBP家族成員,分別命名為Fc-TRBP1-3。我們?cè)诖竽c桿菌Escherichia coli中重組表達(dá)并純化了Fc-TRBP1,隨后使用純化的Fc-TRBP1進(jìn)行對(duì)蝦血細(xì)胞T7噬菌體展示文庫淘選,并得到中國明對(duì)蝦真核翻譯起始因子(Fc-eukaryotic init

3、iation factor6,Fc-eIF6)的部分序列。我們克隆得到Fc-eIF6的全長(zhǎng)cDNA序列,并在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)。利用pull down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了TRBP和eIF6之間存在直接的相互作用。RT-PCR和Northern blot結(jié)果表明Fc-TRBP和Fc-eIF6在所有檢測(cè)的組織中都有表達(dá),對(duì)蝦受鰻弧菌刺激后在所有組織中表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì),在對(duì)蝦受到病毒刺激時(shí)TRBP和eIF6的表達(dá)模式在不同組織中有較大差異,在血細(xì)胞中

4、呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)而在鰓和腸中上調(diào)。Western blot結(jié)果驗(yàn)證了TRBP在肝胰腺和鰓中的表達(dá)模式。注射重組TRBP蛋白可抑制WSSV在對(duì)蝦體內(nèi)的復(fù)制。通過這些結(jié)果可以推測(cè)TRBP和eIF6可能在抗病毒免疫中起重要作用。
　　 隨后我們?cè)谌毡灸覍?duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)中克隆得到TRBP和eIF6的全長(zhǎng)序列。我們對(duì)日本囊對(duì)蝦TRBP(Mj-TRBP)的不同結(jié)構(gòu)域進(jìn)行重組表達(dá)。pulldown實(shí)驗(yàn)證明TRB

5、P結(jié)構(gòu)域B,C介導(dǎo)與eIF6的結(jié)合。Gel-shift結(jié)果表明TRBP結(jié)構(gòu)域A對(duì)dsRNA具有很高的親和力,而結(jié)構(gòu)域B親和力很弱,結(jié)構(gòu)域C不結(jié)合dsRNA但可通過介導(dǎo)17RBP全長(zhǎng)分子的二聚化提高TRBP分子的親和力。RNAi結(jié)果表明TRBP和eIF6參與dsRNA介導(dǎo)的RNA沉默,沉默TRBP和eIF6均可促進(jìn)WSSV的增殖。以上結(jié)果表明,TRBP和eIF6可能通過抗病毒RNA沉默參與對(duì)蝦抗病毒免疫。
　　 2.組織蛋白酶C參

6、與對(duì)蝦的抗病毒先天免疫
　　 組織蛋白酶C,(Cathepsin C,Cath C)是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶,屬于木瓜蛋白酶家族。Cath C能夠激活許多糜蛋白酶樣的絲氨酸蛋白酶(chymotrypsin-like serine proteases)并在免疫和炎癥細(xì)胞中參與調(diào)控許多絲氨酸蛋白酶的活性。在本研究中,我們克隆了中國明對(duì)蝦Cath C的cDNA全長(zhǎng)序列,命名為Fc-Cath C。Fc-Cath C的cDNA長(zhǎng)1445

7、bp,包含1356的bp開放讀碼框(openreading frame,ORF)編碼了451氨基酸長(zhǎng)度的蛋白包括17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。Real time PCR結(jié)果表明Fc-Cath C mRNA在肝胰腺中轉(zhuǎn)錄,并在受鰻弧菌Vibrioanguillarum和白斑病毒(white spot syndrome virus,WSSV)刺激后上調(diào)。通過向?qū)ξr體內(nèi)注射Cath C的抗體后,可促進(jìn)WSSV的增殖以及提高對(duì)蝦受病毒感染后的死亡率。我

8、們的結(jié)果表明Fc-Cath C可能在對(duì)蝦的抗病毒先天免疫中起重要的作用。
　　 3.翻譯控制腫瘤蛋白的基因克隆及功能研究
　　 翻譯控制腫瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)是一種多功能的蛋白,在許多生命過程中發(fā)揮重要的功能。我們從中國明對(duì)蝦中克隆得到TCTP的cDNA全長(zhǎng)序列命名為Fc-TCTP。Fc-TCTP cDNA長(zhǎng)711bp,包含507bp的開放讀