乙型肝炎病毒載體表達(dá)的APOBEC3C抗病毒作用研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的主要臨床表現(xiàn)是慢性乙型肝炎，迄今慢性乙型肝炎的治療效果很不理想，所以科研人員都在積極探索新的治療策略。Natsoulis等于90年代初率先提出了一種全新的抗病毒策略：利用衣殼蛋白靶向滅活病毒(capsid targeted viral inactivation，CTVI)，他們將這個方法應(yīng)用于治療逆轉(zhuǎn)錄病毒的實驗研究，這個方法的主要原理是構(gòu)建抗病毒蛋白與衣殼蛋白重組形成的融

2、合蛋白，病毒組裝時很多衣殼蛋白單體聚合形成衣殼蛋白，融合蛋白可以被病毒當(dāng)做真的衣殼蛋白單體被組裝到病毒核心顆粒中，這樣融合蛋白攜帶的抗病毒蛋白就可以直接作用于核心顆粒內(nèi)部的病毒核酸，干擾核酸合成使之發(fā)生變異失去作用或直接破壞清除病毒核酸，從而達(dá)到控制病毒復(fù)制的目標(biāo)。
　　 2001年Beterams和Nassal將這個方法擴(kuò)展到HBV的實驗研究。他們在HBV核心蛋白羧基端通過linker連接核酸酶(staphylococcal

3、nuclease，SN)。構(gòu)建SN與核心蛋白的融合蛋白，這種被命名為Core-SN的融合蛋白被裝配到病毒核心顆粒中。在與HBV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞后，提取上清液檢測HBV DNA，發(fā)現(xiàn)。DNA滴度下降了95％，實驗顯示Core-SN對核心蛋白和RNA形成核心顆粒沒有影響，然而干擾了核心顆粒內(nèi)部DNA的合成。這個實驗也有不足之處：鈣離子濃度高的情況下SN才能發(fā)揮功能，然而鈣離子濃度在細(xì)胞內(nèi)比較低，也就是說SN對細(xì)胞內(nèi)的病毒沒有作用，只是對

4、分泌到細(xì)胞外的病毒發(fā)揮作用，當(dāng)然就更不能阻止細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的：HBV DNA進(jìn)入細(xì)胞核轉(zhuǎn)化為cccDNA，所以我們應(yīng)當(dāng)尋找能在細(xì)胞內(nèi)直接發(fā)揮抗HBV作用的物質(zhì)。
　　 載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme-catalyticpolypeptide，APOBEC)是近年來新發(fā)現(xiàn)的具有脫氨基作用的一類酶，可以使腺嘌呤(adenine，A)或胞嘧啶(cytosine，C

5、)脫氨基分別轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤(inosine，I)或尿嘧啶(uracil，U)，即A→I或C→U。2007年Thomas報道，APOBEC3C(A3C)對HBV具有抑制作用，HBV核心蛋白與A3C復(fù)合體非常穩(wěn)定，A3C可以使多數(shù)的新合成HBVDNA基因組出現(xiàn)很多鳥嘌呤(guanine，G)→腺嘌呤突變，即G→A。這些研究結(jié)果表明HBV非常容易受到內(nèi)源性人脫氨酶的影響，并提示A3C是機(jī)體固有的抗HBV宿主反應(yīng)因子。然而A3C不容易進(jìn)入核心顆

6、粒內(nèi)部。為此我們利用核衣殼導(dǎo)向的病毒滅活策略構(gòu)建核心蛋白與A3C的融合蛋白，在核心蛋白組裝時將A3C帶進(jìn)核心顆粒內(nèi)部以便其更有效的發(fā)揮抗病毒作用。
　　 本實驗分為兩部分：第一部分我們研究A3C蛋白獨立的抗HBV作用和機(jī)制。在第二部分我們利用核衣殼導(dǎo)向的病毒滅活策略構(gòu)建核心蛋白與A3C的融合蛋白，觀察Core-A3C融合蛋白的抗HBV作用和機(jī)制。主要方法是應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光免疫法(electrochemiluminescence i

7、mmunoassay，ECLIA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg的表達(dá)水平；應(yīng)用Southern blotting方法檢測細(xì)胞裂解液和上清液中HBV DNA觀察抗病毒作用及pCH-LJ3-A3C在輔助質(zhì)粒存在下的復(fù)制能力；應(yīng)用3D-PCR技術(shù)擴(kuò)增核心蛋白相關(guān)的HBV DNA，測定HBV DNA序列，研究Core-A3C融合蛋白抑制病毒機(jī)制；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法研究融合蛋白在細(xì)胞中的定位。
　　 主要研究結(jié)果如下：

8、>　　 第一部分：復(fù)制缺損型HBV載體表達(dá)A3C抗HBV作用。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因A3C，經(jīng)過XhoⅠ和BSP1407Ⅰ雙酶切替換pCH-LJ3-hrGFP中的hrGFP基因，構(gòu)建質(zhì)粒pCH-LJ3-A3C，質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定正確。質(zhì)粒pCH-LJ3一A3C與野生型HBV質(zhì)粒pCH-3093共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞系。首先，應(yīng)用ECLIA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg的表達(dá)水平。結(jié)果顯示pCH-LJ3-A3C組HBsA

9、g表達(dá)水平為對照組的104.4％％±2.25％；HBeAg表達(dá)水平為對照組的98.65％±0.85％，與對照組相比，均無統(tǒng)計學(xué)差異。隨后，應(yīng)用Southern blotting方法檢測細(xì)胞裂解液和上清液HBV DNA，觀察DCH-LJ3-A3C的抗病毒作用。結(jié)果顯示pCH-LJ3-A3C可以抑制細(xì)胞漿內(nèi)病毒DNA，使HBV DNA減少30％，pCH-LJ3-A3C可以抑制上清液中子代病毒顆粒使HBV DNA減少39％。之后，為了研究pC

10、H-LJ3-A3C能否在輔助質(zhì)粒幫助下恢復(fù)復(fù)制能力，pCH-LJ3-A3C與pCH-3142共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞系，Southern blotting方法檢測細(xì)胞裂解液和上清液HBVDNA。結(jié)果顯示裂解液和上清液均檢出病毒DNA。最后，為了研究其抑制病毒機(jī)制，應(yīng)用3D-PCR技術(shù)擴(kuò)增核心顆粒有關(guān)的HBV DNA，與pGEM-T測序載體連接，每組選取50個克隆測序。結(jié)果回報pCH-LJ3-A3C對新合成的HBV DNA發(fā)揮編輯功能產(chǎn)生了G

11、→A的變異，總共36個克隆出現(xiàn)G→A的變異，G→A變異總數(shù)目達(dá)982。
　　 第二部分：HBV載體表達(dá)核心蛋白與A3C融合蛋白抗HBV作用。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因A3C，經(jīng)過BstEⅡ和Acor13HⅠ雙酶切，插入載體質(zhì)粒pdssX中，構(gòu)建質(zhì)粒pCH-Core-A3C，質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定正確。pCH-Core-A3C與野生型HBV質(zhì)粒pCH-3093共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞系。首先，應(yīng)用ECLIA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg

12、和HBeAg的表達(dá)水平。結(jié)果顯示pCH-Core-A3C組HBsAg表達(dá)水平為對照組的97.82％±1.37％，HBeAg表達(dá)水平為對照組的97.16％±0.86％，與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。隨后，應(yīng)用Southern blotting方法檢測細(xì)胞裂解液和上清液HBV DNA，觀察pCH-Core-A3C的抗病毒作用。結(jié)果顯示pCH-Core-A3C可以抑制細(xì)胞漿內(nèi)病毒DNA，使HBV DNA減少84％，pCH-Core-A3C可以抑制

13、上清液中子代病毒顆粒使HBV DNA減少91％。之后，為了研究其抑制病毒機(jī)制，應(yīng)用3D-PCR技術(shù)擴(kuò)增核心顆粒有關(guān)的HBV DNA，與pGEM-T測序載體連接，每組選取50個克隆測序。結(jié)果回報pCH-Core-A3C對新合成的HBV DNA發(fā)揮編輯功能，產(chǎn)生了大量的G→A的變異，總共48個克隆出現(xiàn)G→A的變異，G→A變異總數(shù)目達(dá)2416。最后，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法研究融合蛋白在細(xì)胞中的定位。結(jié)果顯示Core-A3C融合蛋白主要定位于細(xì)胞

14、漿。
　　 綜合前兩部分研究我們得出主要研究結(jié)論如下：
　　 1.成功構(gòu)建了HBV載體表達(dá)核心蛋白與A3C融合蛋白質(zhì)粒pCH-Core-A3C；復(fù)制缺損型HBV載體表達(dá)A3C質(zhì)粒pCH-LJ3-A3C。
　　 2.pCH-LJ3-A3C和pCH-Core-A3C質(zhì)粒對細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg的表達(dá)水平?jīng)]有影響。
　　 3.pCH-Core-A3C轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞系，細(xì)胞免疫化學(xué)顯示Core-

15、A3C融合蛋白主要定位于細(xì)胞漿。
　　 4.pCH-LJ3-A3C在輔助質(zhì)粒pCH-3142提供包裝時形成了完整的HBV顆粒。
　　 5.與野生型HBV質(zhì)粒pCH-3093共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞系，Southern blotting方法檢測發(fā)現(xiàn)pCH-LJ3-A3C和pCH-Core-A3C均可以抑制細(xì)胞裂解液和細(xì)胞上清液HBVDNA，且pCH-Core-A3C抑制病毒復(fù)制作用明顯優(yōu)于pCH-LJ3-A3C。
　　

16、 6.應(yīng)用3D-PCR技術(shù)擴(kuò)增核心顆粒有關(guān)的HBV DNA并克隆至pGEM-T載體，每組選取50個克隆測序，pCH-LJ3-A3C和pCH-Core-A3C均對新合成的HBV DNA發(fā)揮編輯功能產(chǎn)生了G→A的變異，且pCH-Core-A3C的編輯作用明顯優(yōu)于pCH-LJ3-A3C。
　　 總之，我們構(gòu)建了表達(dá)Core-A3C的HBV載體，發(fā)現(xiàn)其對野生型HBV具有較強的的編輯作用，同時還能在輔助病毒存在時形成子代病毒，為下一步的動