新型載體材料PEI-PCL-PEG用于基因遞送的研究.pdf

1、作為基因治療一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，轉(zhuǎn)基因載體仍是研究的一個瓶頸。由于病毒載體的安全性隱患，用化學(xué)方法構(gòu)建非病毒基因輸送體系成為理想的選擇。其主要優(yōu)勢有：無免疫原性、不受輸送基因分子量大小的限制和易于分子構(gòu)建以獲得合適的功能，然而相對較低的轉(zhuǎn)染效率和由載體所帶正電荷導(dǎo)致的化學(xué)毒性限制了非病毒載體的進(jìn)一步應(yīng)用。本論文旨在構(gòu)建一種新型的可降解的基因傳遞系統(tǒng)，以達(dá)到高效低毒的目的，同時能對今后的非病毒載體構(gòu)建和應(yīng)用起到借鑒作用。
　?。?）可生物

2、降解的基因載體PEG-PCL-PEI的合成與表征：首先以辛酸亞錫作為催化劑，聚乙二醇單甲醚（MPEG）為引發(fā)劑，通過開環(huán)聚合反應(yīng)制備二嵌段共聚物（MPEG-b-PCLs），然后將二嵌段共聚物的羥基末端依次活化成為羧基和琥珀酰亞胺端基，形成MPEG-b-PCLs-COOH活化物和MPEG-b-PCLs-NHS活化物；然后將親水性的MPEG-b-PCLs-NHS活化物接枝到聚乙烯亞胺(PEI)的氨基側(cè)鏈上，得到PEI的接枝產(chǎn)物—一種新穎的可

3、生物降解的兩性聚合物（PEI-g-PCL-b-PEG），應(yīng)用FTIR，1H-NMR等分析手段對中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物進(jìn)行表征，GPC檢測聚合物的分子量以及分子量分布。根據(jù)檢測結(jié)果推算出聚合物的平均分子量及接枝率，最終產(chǎn)物為：PEI10K-g-（PCL1.2K-b-MPEG5K）1.4。
　?。?）聚合物/pDNA復(fù)合物體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗研究：用合成的載體材料PEI10K-g-（PCL1.2K-b-MPEG5K）1.4進(jìn)行了體外質(zhì)粒DNA（p

4、DNA）轉(zhuǎn)染實(shí)驗，初步地考察了聚合物/pDNA質(zhì)量比、轉(zhuǎn)染時間、培養(yǎng)基pH對轉(zhuǎn)染效率的影響，結(jié)果證明，聚合物載體PEI10K-g-（PCL1.2K-b-MPEG5K）1.4能夠成功地將質(zhì)粒報告基因pEGFP轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，并且轉(zhuǎn)染效率隨著時間的延長而提高；用pH=6.8的培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染，效果優(yōu)于正常培養(yǎng)基；在聚合物/pDNA質(zhì)量比為10的時候轉(zhuǎn)染效果較好。
　?。?）PEI-PCL-PEG用于siRNA遞送的研究：用PEI10K-g

5、-（PCL1.2K-b-MPEG5K）1.4/siRNA復(fù)合物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗，考察了各N/P比復(fù)合物對螢火蟲熒光素酶基因表達(dá)的沉默效率；研究了復(fù)合物的粒徑、Zeta電位與N/P比（PEI中所含“氮”的納摩爾：DNA中“磷”的納摩爾）的關(guān)系；比較了PEI10K-g-（PCL1.2K-b-MPEG5K）1.4與PEI10K單體兩者遞送siRNA的效果以及兩種載體的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，在N/P=125時對細(xì)胞的基因沉默效果較好，與陽性對照組

6、比較無顯著差異（P＞0.01）；PEI10K-g-（PCL1.2K-b-MPEG5K）1.4/siRNA復(fù)合物的粒徑隨著N/P比的增加而減小，Zeta電位隨著N/P比的增加而升高；轉(zhuǎn)染4T1Luc細(xì)胞的結(jié)果顯示，載體PEI10K-g-（PCL1.2K-b-MPEG5K）1.4遞送siRNA的能力強(qiáng)于PEI10K，兩者具有顯著性差異（P﹤0.01），MTT實(shí)驗數(shù)據(jù)顯示，無論是在相同N/P還是相同濃度時載體PEI10K-g-（PCL1.2K