新型PCL-PEG-Chitosan和PEI600-CyD納米非病毒基因輸送體系的體外研究.pdf

1、目的：
　　 優(yōu)化新型納米非病毒載體PCL-PEG-Chitosan和PEI600-CyD在體外與質(zhì)粒的復(fù)合條件。評(píng)價(jià)這兩種非病毒載體對(duì)于骨關(guān)節(jié)相關(guān)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。研究其與質(zhì)粒組成的復(fù)合物對(duì)于骨關(guān)節(jié)相關(guān)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率，并對(duì)此過程中質(zhì)粒的運(yùn)動(dòng)情況和分布情況進(jìn)行探索。為這些納米非病毒基因輸送體系進(jìn)一步用于骨關(guān)節(jié)疾病的基因治療給予參考。
　　 方法：
　　 1．在體外利用凝膠電泳方法確定非病毒載體與質(zhì)粒復(fù)合的最小氮

2、磷比（N/P）。
　　 2．利用動(dòng)態(tài)光散射粒徑測(cè)量?jī)x確定復(fù)合物在不同氮磷比、不同緩沖溶液體系下粒徑的變化情況。
　　 3．分別從健康雄性SD 大鼠的骨髓中分離得到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），膝關(guān)節(jié)中分離得到滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。利用MTT實(shí)驗(yàn)，來確定非病毒載體PEI600-CyD 分別對(duì)于這三種細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
　　 4．將帶有綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒（pEGFP）同PCL-PEG-Chitosan和PEI600

3、-CyD 進(jìn)行復(fù)合后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，然后利用流式細(xì)胞分析技術(shù)定量統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)染效率。
　　 5．分別利用量子點(diǎn)和熒光素兩種不同的標(biāo)記方法對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行標(biāo)記，并利用激光共聚焦顯微鏡觀察復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，質(zhì)粒在細(xì)胞中的分布情況。
　　 結(jié)果：
　　 1．凝膠電泳結(jié)果顯示非病毒載體PCL-PEG-Chitosan 與pEGFP 復(fù)合的最小氮磷比為4：1，同時(shí)PCL-Chitosan 與pEGFP 復(fù)合的最小氮磷比也為4：1，

4、而Chitosan 與pEGFP 復(fù)合的最小氮磷比則為1：1。
　　 2．動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示非病毒載體PCL-PEG-Chitosan 與pEGFP復(fù)合而成的復(fù)合物的粒徑隨著氮磷比的增大而減小，并且這些復(fù)合物在NaAc 緩沖體系和DMEM 緩沖體系中，粒徑基本一致，相對(duì)穩(wěn)定。
　　 3． MTT 實(shí)驗(yàn)顯示，非病毒載體PEI600-CyD 對(duì)于原代軟骨細(xì)胞，原代滑膜細(xì)胞，原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞毒性要明顯小于非病毒載

5、體PEI-25kDa。
　　 4．利用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PCL-PEG-Chitosan 同pEGFP 在氮磷比為32 時(shí)組成的復(fù)合物對(duì)于293t 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率明顯不及Lipo2000。
　　 5．利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PEI600-CyD 的對(duì)于原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和原代軟骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率要明顯高于Lipo2000，而Lipo2000對(duì)于原代滑膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率要明顯高于PEI600-CyD。
　　 6．利

6、用量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)和熒光素標(biāo)記技術(shù)分別標(biāo)記pEGFP 后發(fā)現(xiàn)，利用PEI600-CyD 轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，質(zhì)粒在細(xì)胞核內(nèi)分布的數(shù)量要高于Lipo2000。
　　 結(jié)論：
　　 1．聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）修飾會(huì)使得殼聚糖（Chitosan）對(duì)于pEGFP的復(fù)合能力有所減弱，提高最低復(fù)合氮磷比。而聚乙二醇（poly(ethylene glycol)，PEG）修飾對(duì)于最低復(fù)合氮磷比則沒有影響。