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文檔簡介
1、目前基因治療主要的發(fā)展障礙之一,就是如何有效地將基因釋放到靶細胞中長期穩(wěn)定的表達,而又較少地產生副作用,即載體的效率、靶向性和安全性的問題。陽離子高分子基因傳遞系統(tǒng)在過去十幾年取得明顯進展,結果表明結構簡單的高分子很難幫助DNA穿越體內及細胞內的所有屏障,針對具體的應用目的,設計多組分、多功能載體將是未來幾年高分子基因治療研究的方向。 樹枝狀納米高分子PMAMM是一種結構復雜的陽離子多聚物載體,具有較高的轉染效率,但作為非病毒載
2、體仍需要在靶向、功能等方面進一步的加以完善,例如引入特異靶向性基團和側鏈功能基團等來修飾多聚物骨架,從而調整和改善載體的性能,賦予載體靶向傳遞基因的能力。 本實驗室已經合成了一種新型的以季戊四醇衍生物為核的聚酰胺-胺型樹枝狀高分子,本文以此為基礎,為了改善這個新型載體的性能,利用對癌細胞表面特異靶向的轉鐵蛋白(Transferdn,Tf)、葉酸(Folic acid,FA)等配體對其進行修飾,構建受體介導的新型靶向載體系統(tǒng),賦予
3、載體對癌細胞靶向性基因傳遞的能力。 具體的研究內容如下: 1.用葉酸對第五代PMAMM (G5 PC-PAMAM) 載體進行表面修飾,合成了G5 PC-PAMAM-FA 并對其進行了表征。修飾后的載體對NIH3T3細胞的細胞毒性較未修飾的載體略小,瓊脂糖凝膠電泳的結果表明當載體與DNA的質量比大于10∶1時,G5 PC-PAMAM-FA能夠完全阻滯DNA在瓊脂糖凝膠中的運動。載體與DNA形成復合物的粒徑穩(wěn)定在210mm左
4、右。當質量比=4∶1時 G5PC-PAMAM-Tf/DNA 復合物的zeta電位穩(wěn)定在22 mv左右。系統(tǒng)的考察了在體外修飾后的載體介導EGFP基因轉染肝癌細胞HepG<,2>細胞的能力,結果表明偶聯(lián)葉酸后提高了原載體的轉染性能。通過比較修飾前后的載體介導基因轉染癌細胞和正常細胞的差異,初步檢驗了修飾后載體對癌細胞具有了靶向性。 2.以G5 PC-PAMAM 為載體,通過二硫鍵共軛交聯(lián)的方法將轉鐵蛋白偶聯(lián)在載體表面上,分子篩層析
5、進行純化分離,合成出具有癌細胞靶向的基因載體 G5PC-PAMAM-Tf。這種載體對NIH3T3細胞的細胞毒性均遠小于PEI和PLL。凝膠電泳的結果發(fā)現,當載體與DNA的質量比>10∶1時,G5 PC-PAMAM-Tf能夠與DNA完全形成聚電解質復合物。當與DNA的質量比>20∶1后,G5PC-PAMAM-Tf 載體與DNA形成復合物的粒徑穩(wěn)定在450nm左右。在質量比=10∶1時G5 PC-PAMAM-Tf/DNA復合物的zeta電位
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