VEGF-BSA-PCL-PEG同軸納米纖維緩釋載體的構建及體外血液相容性和生物學活性的研究.pdf

1、第一部分:VEGF-BSA/PCL-PEG同軸納米纖維緩釋載體的構建
　　【目的】:以聚己內(nèi)脂(PCL)為材料,采用同軸靜電紡絲法制備出VEGF-BSA/PCL-PEG芯殼結構的納米纖維,考察電壓對纖維結構及直徑的影響規(guī)律。
　　【材料和方法】:同軸靜電紡絲的殼層溶液是以氯仿和乙醇(v/v,60:40)為溶劑的聚己內(nèi)酯溶液,聚己內(nèi)酯的濃度為0.1g/ml,另外每毫升溶液加入0mg,1mg,10mg,20mg的聚乙二醇,聚乙二

2、醇是一種致孔劑,可以加快芯層結構物質的釋放。芯層溶液是以PBS為溶劑,溶質是牛血清蛋白(BSA)和內(nèi)皮生長因子(VEGF),牛血清蛋白為穩(wěn)定劑,牛血清蛋白和內(nèi)皮生長因子的濃度分別為0.01g/ml和10μg/ml。待溶液完全溶解后,分別注入注射器,在常溫下,芯層以0.5ml/h,殼層以2ml/h,分別在15kv,16kv,17kv,18kv下進行靜電紡絲,制備VEGF-BSA/PCL-PEG納米纖維。室溫下真空干燥箱下干燥24h,然后放

3、40C冰箱備用。
　　【結果】:將分別在15kv,16kv,17kv,18kv制的VEGF-BSA/PCL-PEG納米纖維在掃描電子顯微鏡(SEM)下進行檢測。觀察其形貌特征,并用Image-J軟件隨機計數(shù)30根纖維的直徑,結果顯示隨著電壓的增大,纖維的直徑也略微增大。將16kv下的VEGF-BSA/PCL-PEG納米纖維在投射電子顯微鏡(TEM)下檢測,可以觀察到明顯的芯殼結構。
　　【結論】:成功的構建出了攜帶VEGF的

4、VEGF-BSA/PCL-PEG具有芯殼結構的納米緩釋載體。
　　第二部分:VEGF-BSA/PCL-PEG納米纖維緩釋BSA和VEGF的研究
　　【目的】:探究應用同軸靜電紡絲法制備出VEGF-BSA/PCL-PEG同軸納米纖維緩釋VEGF和BSA的可行性,根究不同階段測得VEGF和BSA的濃度,繪制出時間-累積釋放量(％)曲線圖,探究其釋放規(guī)律。并檢測釋放出來的VEGF的生物學活性。
　　【材料和方法】:用同軸靜電

5、紡絲法制的BSA/PCL,BSA/PCL-PEG(100/1,m/m),BSA/PCL-PEG(10/1,m/m),BSA/PCL-PEG(5/1,m/m),將以上每組各5個試件放入盛有4ml的1×PBS溶液6孔板中,并放入370CO2溫育箱中,在第1,3,7,15,30天取出2ml溶液檢測BSA的濃度,在將其用新鮮的1×PBS溶液補充到4ml,根據(jù)BCA蛋白定量的方法檢測取出來的溶液濃度,并根據(jù)濃度繪制出時間-累計釋放量(%)曲線,再

6、用同樣的方法制備出VEGF-BSA/PCL-PEG(5:1,m/m),根據(jù)上述的方法用VEGFELISA試劑盒檢測VEGF的濃度,根據(jù)濃度繪制出時間-累計釋放量(%)曲線圖。將第1,3,7天釋放出來的VEGF根據(jù)其濃度調整到1ng/ml,加入到1×104濃度的內(nèi)皮細胞中,3天后進行細胞計數(shù),繪制出其細胞增殖率直方圖,并以空白和新鮮的VEGF作為對照,并比較它們的生物學活性。
　　【結果】:BSA/PCL,BSA/PCL-PEG(1

7、00/1,m/m),BSA/PCL-PEG(10/1,m/m),BSA/PCL-PEG(5/1,m/m)中的BSA在第一天都小的集中釋放,BSA/PCL中的BSA釋放量在30天內(nèi)不到60%,而BSA/PCL-PEG(100/1,m/m),BSA/PCL-PEG(10/1,m/m),BSA/PCL-PEG(5/1,m/m)在30天內(nèi)釋放連都到達90%以上,PEG可以加速其釋放。VEGF-BSA/PCL-PEG(5:1,m/m)中的VEGF

8、在30天的時間內(nèi)逐漸釋放,30天的累積釋放量為98%。釋放出來VEGF的生物學活性與新鮮的VEGF相比沒有顯著性差異(p>0.05)。
　　【結論】:VEGF-BSA/PCL-PEG納米纖維可以緩釋VEGF和BSA,在體外實驗中可以持續(xù)30天,同時釋放出來的VEGF生物學活性沒有發(fā)生變化。
　　第三部分:VEGF-BSA/PCL-PEG納米纖維體外血液相容性和生物學活性的研究
　　【目的】:評價VEGF-BSA/PCL

9、-PEG(5:1,m/m)同軸靜電紡絲膜的物理特性,體外血液相容性和生物學活性,探求其作為人工心血管替代材料的可行性
　　【材料和方法】:通過靜電紡絲技術制備VEGF-BSA/PCL-PEG(5:1,m/m)同軸靜電紡絲膜,然后進行體外溶血實驗,動態(tài)凝血實驗,凝血時間測定,血小板黏附實驗,細胞毒性實驗,體外細胞粘附實驗對其血液相容性和生物學活性進行評價,并與Dacron作平行對照。
　　【結果】:VEGF-BSA/PCL-P

10、EG納米纖維的體外外溶血實驗,動態(tài)凝血實驗,凝血時間測定,血小板黏附實驗與Dacron相比無顯著性差異(p>0.05),用CCK8檢測方法對VEGF-BSA/PCL-PEG納米纖維體進行毒性檢測,其相對增殖率(RGR)>90%,表明細胞的增長沒有受到抑制,說明為VEGF-BSA/PCL-PEG納米纖維無細胞毒性的。
　　【結論】:VEGF-BSA/PCL-PEG(5:1,m/m)同軸靜電紡絲膜血液相容性較高,于Dacron相當,且