納米載體材料的生物相容性研究.pdf

1、納米材料是當(dāng)今科研發(fā)展最為熱門的領(lǐng)域之一，各種生物納米材料已經(jīng)廣泛地用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。納米載體材料，必須具有良好的生物相容性，才能確保安全的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。納米載體材料的生物相容性評(píng)價(jià)主要包括:血液相容性，免疫相容性與全身毒性等。不引起明顯的臨床反應(yīng)，及能耐受宿主各系統(tǒng)的作用而保持相對(duì)穩(wěn)定，不被排斥和破壞的生物性原則，評(píng)價(jià)為納米載體材料相容性良好。納米載體材料進(jìn)入機(jī)體后，不可避免的將與血液接觸，不僅會(huì)與血液系統(tǒng)中的血細(xì)胞和蛋白產(chǎn)生各種反

2、應(yīng)，而且還能夠被宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別，產(chǎn)生復(fù)雜的免疫反應(yīng)。納米載體材料的血液相容性與免疫相容性研究，具有重要的理論和臨床價(jià)值。
　　單壁碳納米管(Single-Walled Carbon Nanotubes，SWCNTs)，作為一種納米載體材料，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域主要用作靶向藥物載體、基因載體等。由于單壁碳納米管(SWCNTs)在獨(dú)特的生物化學(xué)性質(zhì)，在水溶液很難分散、容易聚集，給實(shí)際應(yīng)用帶來了巨大的困難。解決這一難題的方法，主要包括化學(xué)

3、修飾（表面添加官能團(tuán)）和物理修飾（表面結(jié)合溶解劑，不改變化學(xué)結(jié)構(gòu)）。不管用那種方法進(jìn)行處理，單壁碳納米管作為生物醫(yī)藥載體應(yīng)用時(shí)，了解它的血液相容性對(duì)于單壁碳納米管的安全使用具有重要意義。雖然已有諸多文獻(xiàn)研究報(bào)道，碳納米管會(huì)降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性，促進(jìn)內(nèi)源性凝血，誘發(fā)血小板的活化和聚集等，但是關(guān)于羧基化單壁碳納米管對(duì)紅細(xì)胞的作用以及對(duì)血栓力學(xué)性質(zhì)和凝血過程的影響的報(bào)道十分有限。
　　聚酰胺-胺（Polyamidoamine，PAMA

4、M）作為一種新型納米材料是目前研究最為深入和廣泛的樹狀大分子，根據(jù)末端所帶官能團(tuán)的不同，目前市售聚酰胺-胺（PAMAM）主要分為PAMAM-NH2、PAMAM-OH、PAMAM-COOH、PAMAM-C12、PAMAM-NH2/OH（混合表面）及PAMAMOS-TMOS（有機(jī)硅表面）等，其中尤以前三種研究最為廣泛。聚酰胺-胺(PAMAM)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的主要用作靶向藥物載體、基因載體、造影劑等。這些納米載體材料在實(shí)際應(yīng)用中，它們將對(duì)機(jī)體

5、產(chǎn)生怎樣的影響，同時(shí)，它們的生物醫(yī)用功能是否會(huì)發(fā)生改變等。這些問題對(duì)于聚酰胺-胺(PAMAM)安全使用到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域至關(guān)重要。
　　因此，我們選用單壁碳納米管(SWCNTs)為模型，對(duì)其表面進(jìn)行化學(xué)氧化修飾，進(jìn)一步研究其對(duì)血液中紅細(xì)胞形貌和凝血功能的影響。此外，我們還選用聚酰胺-胺(PAMAM)為模型，采用生物化學(xué)、細(xì)胞及分子生物學(xué)以及免疫學(xué)等研究手段，著力探討該聚合物所帶不同表面官能團(tuán)(氨基(-NH2)、羥基(-COOH)、羧基(-

6、OH))，所引發(fā)的免疫應(yīng)答將會(huì)發(fā)生怎樣的變化，初步闡明聚酰胺-胺(PAMAM)的不同表面基團(tuán)對(duì)免疫分子、免疫細(xì)胞、抗原抗體反應(yīng)及補(bǔ)體激活的影響。本研究，將為規(guī)避新型納米載體材料的應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)，推動(dòng)新型納米載體材料的優(yōu)化設(shè)計(jì)和應(yīng)用，篩選及優(yōu)化具有免疫調(diào)控功能的納米載體材料用于免疫治療。
　　第一章 羧基化單壁碳納米管的制備與其血液相容性研究
　　目的：
　　本研究旨在對(duì)單壁碳納米管(SWCNTs)進(jìn)行羧基化改性并

7、對(duì)改性前后的SWCNTs進(jìn)行血液相容性研究。
　　方法：
　　利用濃硫酸與濃硝酸(3∶1，v/v)在加熱條件下將單壁碳納米管(SWCNTs)氧化成羧基化單壁碳納米管(SWCNT-COOH)，采用紅外光譜儀(FTIR)、馬爾文激光粒徑儀對(duì)材料粒徑和表面電荷進(jìn)行表征。采用掃描電子顯微鏡(TEM)觀察修飾前后的SWCNTs對(duì)紅細(xì)胞聚集和形貌的影響。采用血栓彈力圖儀(TEG)檢測(cè)修飾前后的SWCNTs對(duì)凝血功能的影響。
　　結(jié)

8、果：
　　利用濃硫酸與濃硝酸化學(xué)氧化法成功地將SWCNT表面進(jìn)行羧基化處理。10mg/mL的SWCNT-COOH引起紅細(xì)胞聚集和形貌變化。0.01 mg/ml SWCNTs和0.001 mg/mL SWCNT-COOH促進(jìn)了凝血因子的活化。
　　結(jié)論：
　　用濃硫酸和濃硝酸化學(xué)氧化法可有效地制備SWCNT-COOH。通過紅細(xì)胞形態(tài)觀察和凝血實(shí)驗(yàn)，揭示了SWCNTs和SWCNT-COOH的血液相容性，為SWCNT-COO

9、H的優(yōu)化設(shè)計(jì)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了重要的依據(jù)。
　　第二章 聚酰胺-胺(PAMAM)免疫相容性的初步研究
　　目的：
　　深入闡明聚酰胺-胺（PAMAM）的不同表面基團(tuán)（氨基、羥基、羧基）對(duì)免疫分子、免疫細(xì)胞、抗原抗體反應(yīng)及補(bǔ)體激活的影響。
　　方法：
　　采用紫外光譜學(xué)、熒光光譜學(xué)和圓二色普光譜學(xué)來研究聚酰胺-胺(PAMAM)對(duì)γ-球蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的影響。通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)研究聚酰胺-胺（PAMAM）

10、對(duì)補(bǔ)體激活的影響。采用紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)研究聚酰胺-胺（PAMAM）對(duì)抗原抗體反應(yīng)的影響。此外，通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究聚酰胺-胺(PAMAM)對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性，以及利用吞噬實(shí)驗(yàn)來研究聚酰胺-胺(PAMAM)對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。
　　結(jié)果：
　　聚酰胺-胺（PAMAM）能夠改變?chǔ)?球蛋白的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，抑制補(bǔ)體激活。第5代末端帶有羧基(-COOH)的聚酰胺-胺(PAMAM)在10 mg/mL會(huì)破壞紅細(xì)胞的抗原

11、抗體反應(yīng)。末端所帶的官能團(tuán)不同（氨基、羥基、羧基）的聚酰胺-胺（PAMAM）對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性也一樣，G5 PAMAM-NH2（氨基）＞G5 PAMAM-COOH(羧基)＞G5 PAMAM-OH（羥基），而羥基的沒產(chǎn)生細(xì)胞毒性。從形態(tài)上觀察，聚酰胺-胺(PAMAM)對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能沒有影響。
　　結(jié)論：
　　聚酰胺-胺（PAMAM）對(duì)免疫分子和免疫細(xì)胞、以及免疫應(yīng)答的影響主要依賴它們的整體結(jié)構(gòu)和表面所帶