基于組裝方法構(gòu)建新型高性能基因遞送系統(tǒng).pdf

1、基因治療是一種通過編輯細胞內(nèi)基因或引入外源治病基因，從根本上實現(xiàn)對疾病治療的方法。然而，這一理念的實現(xiàn)需要突破復(fù)雜的組織及細胞屏障將基因遞送到細胞中，并在不破壞機體正常功能的條件下表達出治療分子。此外，普通的化學(xué)藥物治療需要足夠的血藥濃度才能達到治療目的，相似地，基因治療的實現(xiàn)也需基因遞送到足夠多的靶細胞中，以實現(xiàn)治病目的。在過去的近30年時間里，臨床基因治療被用于遺傳性疾病、癌癥、慢性傳染病等的治療。相當(dāng)數(shù)量的臨床Ⅰ/Ⅱ期實驗證明了基

2、因治療方法對于一些危重大疾病包括遺傳性血液病、神經(jīng)及免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病等具有突出的療效。鑒于基因治療實現(xiàn)的藥物“核酸”在體內(nèi)易降解，這些治療都利用了載體構(gòu)建出遞送系統(tǒng)的技術(shù)來實現(xiàn)。
　　有效的基因治療與低毒、高效的基因載體密不可分。鑒于病毒性基因載體具有免疫原性等諸多缺陷，非病毒性基因載體以勢不可擋的姿態(tài)進入了科學(xué)家的視野。而在不同類型、不同遞送原理的非病毒類載體中，研究最為廣泛的是陽離子基因載體。以此為基礎(chǔ)的遞送系統(tǒng)更加多樣和安全

3、，但與病毒性載體相比，其效率還有很大的提升空間。目前的基因遞送系統(tǒng)研究更多的集中在提高細胞吞噬率這一點，事實上，基因的表達受到諸多因素的影響，包括細胞質(zhì)內(nèi)基因的穩(wěn)定存在，以及內(nèi)涵體逃逸以后，細胞內(nèi)基因順利釋放并表達。
　　本論文主要以來源廣泛、相容性好、可降解的生物分子為基礎(chǔ)，致力于通過組裝這一非共價鍵連接的方式，設(shè)計制備出既具有較高的吞噬率、又具有核酸釋放促進功能的陽離子聚合物基因藥物遞送系統(tǒng)。
　　首先，我們選取聚天冬氨

4、酸這一低毒、生物可降解、生物相容性好的聚合物，設(shè)計合成了環(huán)糊精-苯環(huán)主客體組裝超分子，用于基因遞送系統(tǒng)的研究。我們分別制備了星型、以環(huán)糊精為核的基于聚天冬氨酸的聚陽離子，以及帶有苯環(huán)側(cè)鏈基團的線型聚天冬氨酸骨架。通過環(huán)糊精與苯環(huán)的主-客體組裝，將星型聚陽離子與線型骨架組裝在一起，得到一系列可作為基因治療遞送系統(tǒng)使用的基于聚天冬氨酸的具有生物可降解性的超分子組裝體。制備得到的超分子組裝體表現(xiàn)出良好的降解性、較高的核酸縮合能力，較低的細胞毒

5、性。更重要的是，在不同的材料(N)/核酸(P)比例下，超分子組裝體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染效率明顯高于其主-客體組裝中的主體，即環(huán)糊精的星型聚天冬氨酸聚陽離子衍生物。除此之外，通過自殺基因治療體系進行的體外抗癌實驗，也進一步證實了組裝體的高效率。這一研究為設(shè)計制備可降解超分子藥物遞送系統(tǒng)提供了新的思路和方法。
　　其次，我們在組裝結(jié)構(gòu)設(shè)計促進基因轉(zhuǎn)染效率的基礎(chǔ)上，嘗試引入具有更強電荷競爭力的肝素，進一步促進核酸釋放，提高組裝遞送系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)

6、染效率。肝素，作為一種具有高密度的負電荷的多糖，通過“graft onto”等化學(xué)修飾手段，在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。但由于肝素單一的溶解性，極大的限制了其化學(xué)改性，進而限制了其應(yīng)用領(lǐng)域。在本工作中，我們首先報道了一種改性肝素溶解性的方法，即通過引入四丁基銨組分將肝素由水溶性改性成油/水兩親性以用于進一步化學(xué)修飾。隨后，我們通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP）反應(yīng)合成了一系列肝素為骨架的梳型共聚物，并通過組裝形成了包含肝素的凝膠結(jié)

7、構(gòu)型聚合物納米顆粒。我們測試了這些納米顆粒的pDNA縮合能力、細胞毒性以及轉(zhuǎn)染能力，并與已報道的基因載體相比較。這些納米顆粒被證實具有高轉(zhuǎn)染和低毒性，是有效的基因遞送系統(tǒng)。證明了將可降解肝素負電性生物分子引入進入基因載體，可以在保證轉(zhuǎn)染效率的同時，有效的降低載體毒性。同時，我們也證實了，通過改性肝素的溶解性，進而對其進行聚合物接枝修飾和功能化以拓寬其應(yīng)用是可以實現(xiàn)的。我們的研究也為拓寬肝素化學(xué)改性方式及應(yīng)用領(lǐng)域提供了基礎(chǔ)。
　　最

8、后，我們基于肝素溶解性的改性手段，設(shè)計合成了一種新型低毒性核-殼結(jié)構(gòu)的納米組裝體(Hep@PGEA)。這種組裝體帶有可解鎖的負電性肝素核心(HepNP)，通過還原響應(yīng)解鎖，釋放后的肝素與外層殼結(jié)構(gòu)中的陽離子聚合物PGEA作用，促進其中縮合的核酸的釋放。除此之外，作為一種眾所周知的負電性多糖，具有豐富的磺酸基團，除了與陽離子發(fā)生較強的相互作用，還具有促進血管生成、抗凝、抗炎等作用，對心血管疾病具有重要意義。Hep@PGEA被證實對miRN

9、A和pDNA都可以實現(xiàn)高效遞送，并通過分別遞送功能核酸實現(xiàn)了針對心梗這一典型心血管疾病模型的高效基因治療。同時，我們通過實驗證實，隨心梗的發(fā)展，心臟組織中谷胱甘肽(GSH)含量呈升高趨勢，有利于還原解鎖Hep@PGEA載體系統(tǒng)中NA的釋放。隨后，我們提出了分階段遞送的治療方法，通過Hep@PGEA對miR-499和pVEGF的分階段遞送，實現(xiàn)了在心梗初期時抑制心肌細胞凋亡、降低心臟損傷，隨后促進血管再生、恢復(fù)心臟血供的分步的體系化治療。

10、這一分階段核酸遞送在保持和恢復(fù)缺血后心臟功能，減小梗死面積、促進血管再生以及抑制心肌細胞肥大方面取得了令人驚喜的結(jié)果。除此之外，由于生物還原劑在生物體的廣泛存在，我們提出的可解鎖肝素組裝納米復(fù)合體以及分階段治療策略也將為其他危重疾病提供新的方法和思路。
　　綜上所述，我們以可降解、生物相容性好的聚天冬氨酸或肝素多糖為基礎(chǔ)，結(jié)合組裝和原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的方法，制備出較低毒性、可以促進核酸釋放的陽離子聚合物基因載體，實現(xiàn)高效地基因遞送