2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一個(gè)全球公共健康難題,常規(guī)治療策略的效果不盡如人意。基因治療為肝癌尤其是進(jìn)展期肝癌的治療帶來了一線曙光,截止目前共有17項(xiàng)肝細(xì)胞癌基因治療臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行,有望成為肝癌的克星。
  基因治療載體決定了治療基因表達(dá)的特異性和效率,對它的設(shè)計(jì)和構(gòu)建是基因治療的關(guān)鍵因素和研究難點(diǎn)?;蛑委熭d體要保護(hù)治療基因免遭核酸酶破壞,并能夠特異性識(shí)別和進(jìn)入靶細(xì)胞,之后還要面臨復(fù)雜

2、的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,完成“逃離內(nèi)吞體”、避免“溶酶體降解”、定位到細(xì)胞核并啟動(dòng)治療基因表達(dá)等一系列極具挑戰(zhàn)的任務(wù)。
  近年來,人工設(shè)計(jì)仿生載體(Designer biomimetic vector,DBV)作為基因治療載體備受矚目。一個(gè)高效的仿生載體包括核酸濃縮基序(DNA condensingmotif,DCM)、靶向肽段(Targeted peptide,TP)、內(nèi)吞體裂解基序(Endosomedisrupting motif,E

3、DM)、核定位信號(hào)(Nuclear localization signal,NLS)等基本要素。DBV通過DCM與治療基因自組裝成納米尺寸的顆粒,防止血清中核酸酶對治療基因的降解;TP的靶向作用可以經(jīng)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑將基因治療載體攜帶至靶細(xì)胞內(nèi);而EDM能夠破壞內(nèi)吞體膜將基因治療載體從內(nèi)吞體釋放至胞漿中,并通過NLS的核定位作用將其定位至胞核實(shí)現(xiàn)治療基因的高效表達(dá)。
  本人所在的課題組既往的研究證實(shí)來源于瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白(C

4、ircumsporozoite protein,CSP)的CSR2a肽段是一個(gè)新的理想的肝特異性靶向配體分子,對構(gòu)建高效的肝癌基因治療靶向遞送系統(tǒng)具有較高的研究價(jià)值。另外,我們前期通過分析、鑒定獲得了一種新型腫瘤特異性啟動(dòng)子-FZD7(Frizzled-7)啟動(dòng)子,研究證實(shí)其具有突出的肝癌特異性和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。
  目的:
  在本研究中,以CSR2a作為特異配體設(shè)計(jì)、構(gòu)建及評(píng)價(jià)了一種新型肝靶向納米多肽遞送系統(tǒng),為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)

5、FZD7啟動(dòng)子調(diào)控下的肝癌精準(zhǔn)治療奠定基礎(chǔ)。
  方法:
  1.設(shè)計(jì)并利用基因工程重組技術(shù)制備基于CSR2a小肽的肝靶向遞送DBV。用免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證His-tag;采用紅細(xì)胞溶血和組織蛋白酶D酶切位點(diǎn)鑒定實(shí)驗(yàn),檢測DBV pH依賴的內(nèi)吞體胞膜裂解功能及靶向配體分子的釋放效應(yīng)。
  2.將DBV與質(zhì)粒pEGFP-N1進(jìn)行混合,對影響包裹率的緩沖液、孵育溫度及孵育時(shí)間等因素進(jìn)行分析;利用瓊脂糖凝膠電泳、Zeta電位儀、

6、Nanosight納米顆粒分析儀和透射電子顯微鏡等對所形成納米顆粒的粒徑、負(fù)載電荷、pH穩(wěn)定性、中和效應(yīng)等表征進(jìn)行分析。
  3.通過血清穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、靶向肽段抑制試驗(yàn)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)分析納米粒子DBV/pEGFP-N1的抗核酸酶降解能力、肝靶向性、細(xì)胞毒性等性能;最后,采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DBV的肝靶向遞送功能。
  結(jié)果:
  1.成功制得8種較高純度的DBV,其中只有DBV3的靶向肽段可被切除,被用于后

7、續(xù)實(shí)驗(yàn);pH7.4時(shí)DBV3不會(huì)使紅細(xì)胞裂解,而pH5.5時(shí)發(fā)生裂解,證實(shí)了DBV3在酸性條件下具有胞膜裂解能力。
  2.室溫或者37℃條件下,在pH5.5的醋酸鹽緩沖液中N/P(氮磷比)為10時(shí),孵育1h更利于納米顆粒的自組裝,包裹率達(dá)到(99.1±0.7)%,所形成的DBV3/pEGFP-N1球形納米粒子水合粒徑為132±3.1nm,負(fù)載電荷為+28.5±1.3 mV。
  3.DBV3/pEGFP-N1納米粒子中的p

8、EGFP-N1質(zhì)粒不會(huì)被血清中的核酸酶降解;靶向肽CSR2a與細(xì)胞孵育后,可以競爭性抑制DBV3/pEGFP-N1的肝靶向性能;DBV3/pEGFP-N1對細(xì)胞沒有明顯的毒性效應(yīng),且可以靶向進(jìn)入正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞;硫酸長春新堿可以抑制DBV3/pEGFP-N1向核運(yùn)輸;體內(nèi)遞送實(shí)驗(yàn)中,正常肝組織中有明顯熒光,而心、腎、脾、胃等組織中并未有熒光蛋白表達(dá)。
  結(jié)論:
  本研究成功構(gòu)建了一種以CSR2a小肽作為特異性肝靶向配

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