結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中S100A1、S100A6對(duì)CacyBP-SIP核轉(zhuǎn)位的影響.pdf

1、鈣周期素結(jié)合蛋白(calcylinbindingprotein,CacyBP)是Filipek等首先從艾氏腹水瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種約30kDa的蛋白質(zhì),其可以和鈣周期素(calcyclin或S100A6)結(jié)合,故此得名;之后在研究P53誘導(dǎo)的β-catenin泛素化降解新通路時(shí),發(fā)現(xiàn)一種可以與sina的同源基因Siah-1(seveninabsentiahomolog1)結(jié)合的蛋白,被命名為SIP(Siah-1interactingpro

2、tein),經(jīng)序列分析,SIP和鼠CacyBP93％相同,因此,認(rèn)為SIP即為人CacyBP。目前就把鈣周期素結(jié)合蛋白命名為CacyBP/SIP。
　　CacyBP/SIP是S100家族的靶蛋白之一,可以和S100A1、S100A6、S100A12、S100B及S100P結(jié)合。同時(shí),S100蛋白又是以EF-手形(EF-hand)結(jié)構(gòu)為特點(diǎn)的鈣結(jié)合蛋白家族成員之一,當(dāng)其和Ca2+結(jié)合后,構(gòu)象發(fā)生改變,結(jié)合相應(yīng)的靶蛋白,發(fā)揮自身特異的

3、生物學(xué)效應(yīng)。此外,研究顯示,神經(jīng)元細(xì)胞未受刺激時(shí),Ca2+濃度為50nM,CacyBP/SIP位于細(xì)胞質(zhì)中;用KCI處理細(xì)胞后使Ca2+濃度升至300nM,CacyBP/SIP環(huán)狀定位于核周,即神經(jīng)元細(xì)胞中Ca2+濃度的變化可以誘導(dǎo)CacyBP/SIP的核轉(zhuǎn)位,那么Ca2+是否通過與S100結(jié)合,激活S100活性,并通過S100與CacyBP/SIP結(jié)合,使CacyBP/SIP作為第三信使進(jìn)入細(xì)胞核傳遞信號(hào),本課題將對(duì)此進(jìn)行探討。

4、>　　目的
　　1.結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中Ca2+濃度變化對(duì)CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位的影響。2.結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中,核轉(zhuǎn)位前后S100A1、S100A6與CacyBP/SIP的結(jié)合情況及結(jié)合量的變化情況;抑制相應(yīng)S100蛋白表達(dá),觀察其對(duì)CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位的影響。
　　方法
　　1.給予不同濃度Ca2+載體ionomycin(0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L

5、)刺激結(jié)腸癌SW480細(xì)胞,通過間接免疫熒光,激光共聚焦觀察CacyBP/SIP在細(xì)胞內(nèi)的定位變化,并動(dòng)態(tài)掃描細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化,記錄細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的相對(duì)水平。2.給予Ca2+載體ionomycin(5μmol/L)和不同濃度Ca2+拮抗劑BAPTA/AM(0μM、5μM、10μM、25μM)共同刺激結(jié)腸癌SW480細(xì)胞,通過間接免疫熒光,激光共聚焦觀察Ca2+濃度降低后CacyBP/SIP在細(xì)胞內(nèi)的定位變化,并動(dòng)態(tài)掃描細(xì)胞內(nèi)

6、熒光強(qiáng)度的變化,記錄細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的相對(duì)水平。3.采用MTT法檢測細(xì)胞的活力及用AnnexinV/PI法檢測細(xì)胞凋亡的情況,排除由于細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載對(duì)本實(shí)驗(yàn)的影響。4.升高Ca2+濃度,采用免疫共沉淀法檢測核轉(zhuǎn)位前后S100A1、S100A6與CacyBP/SIP的結(jié)合情況及結(jié)合量的變化情況。5.設(shè)計(jì)針對(duì)S100A6的三組siRNA,通過Real-TimePCR和Westernblot方法篩選出一組沉默效果最好的siRNA,轉(zhuǎn)

7、染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞,免疫熒光檢測抑制S100A6表達(dá)對(duì)CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位的影響。
　　結(jié)果
　　1.CacyBP/SIP主要位于細(xì)胞質(zhì)中(未給刺激時(shí)),在給予ionomycin刺激后CacyBP/SIP發(fā)生核轉(zhuǎn)位,并于5μmol/L刺激時(shí)核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象最為明顯(CacyBP/SIP主要位于細(xì)胞核中),隨ionomycin濃度(10μmol/L)進(jìn)一步升高,CacyBP/SIP又重新分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核;同時(shí)用iono

8、mycin處理細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度逐漸增高,且于5μmol/Lionomycin刺激時(shí)最高,之后隨ionomycin濃度升高Ca2+濃度趨于平穩(wěn)(P=0.000)。這一結(jié)果說明當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高后CacyBP/SIP轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核,且隨著Ca2+濃度的進(jìn)一步升高,CacyBP/SIP又重新分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。
　　2.隨BAPTA/AM刺激濃度的升高發(fā)生核轉(zhuǎn)位的CacyBP/SIP又重新聚集細(xì)胞質(zhì);同時(shí)細(xì)胞內(nèi)游離Ca

9、2+濃度隨BAPTA/AM刺激濃度的升高逐漸降低(P=0.000)。這一結(jié)果說明細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的降低可以使發(fā)生核轉(zhuǎn)位的CacyBP/SIP返回細(xì)胞質(zhì)。
　　3.MTT法檢測顯示處理組SW480細(xì)胞的細(xì)胞存活率與未處理組無顯著差異(P=0.985);AnnexinV/PI法檢測也未發(fā)現(xiàn)明顯的早期凋亡的情況(P=0.168)。這一結(jié)果說明細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
　　4.發(fā)生核轉(zhuǎn)位前后S10

10、0A1、S100A6都與CacyBP/SIP結(jié)合,但結(jié)合量及其變化明顯不同;S100A1與CacyBP/SIP的結(jié)合量少,且核轉(zhuǎn)位前后結(jié)合量之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),這提示S100A1可能對(duì)CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位沒有影響或影響很小;但是在發(fā)生核轉(zhuǎn)位后S100A6與CacyBP/SIP的結(jié)合量較轉(zhuǎn)位前明顯增加(P<0.05),且明顯高于轉(zhuǎn)位后S100A1的結(jié)合量(P<0.05),這提示S100A6可能在CacyBP/SI

11、P的核轉(zhuǎn)位中發(fā)揮了重要作用。
　　5.通過Real-TimePCR和Westernblot方法檢測發(fā)現(xiàn)siRNA-S100A6-2組沉默效果最好,抑制率分別為87.9%和85.0%,故選用siRNA-S100A6-2干預(yù)SW480細(xì)胞,使S100A6蛋白表達(dá)受到抑制,再給予5μmol/Lionomycin刺激時(shí),核轉(zhuǎn)位受到明顯抑制,CacyBP/SIP定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,并未完全轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中,這進(jìn)一步說明S100A6在Cacy

12、BP/SIP的核轉(zhuǎn)位中發(fā)揮了重要作用。
　　結(jié)論
　　1.在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高后CacyBP/SIP轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核,隨著Ca2+濃度的進(jìn)一步升高,其又重新分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,且Ca2+濃度降低亦可使發(fā)生核轉(zhuǎn)位的CacyBP/SIP返回細(xì)胞質(zhì),即在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中,隨著細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化,CacyBP/SIP發(fā)生了進(jìn)出核的轉(zhuǎn)位。
　　2.在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中,核轉(zhuǎn)位前后S10