S100A2和S100A6對結腸癌細胞株HCT116和骨肉瘤細胞株MG63的生物學作用.pdf

1、腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素作用、多基因參與、經歷多個階段的復雜生物學過程，有許多信號分子參與其中。積極探討這些信號分子對細胞的作用和機制，及其信號分子之間的相互關系，將有助于闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制。S100蛋白家族是一類具有EF-手形結構的信號分子，有25個成員，與鈣離子及其靶蛋白結合后發(fā)揮多種生理功能，參與細胞增殖和分化、鈣穩(wěn)態(tài)、蛋白質磷酸化、酶活性和轉錄因子的調節(jié)。其中21個成員的基因定位于人染色體lq21，該區(qū)段染色體穩(wěn)定性差，易

2、發(fā)生多種染色體重排和基因擴增。現己發(fā)現多個S100成員在腫瘤中表達異常，并與腫瘤的增殖、浸潤轉移和凋亡密切相關，S100A2和S100A6就是其中的兩個成員。 S100A2在多種腫瘤中表達減少或缺失，如惡性黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤，且S100A2的缺失表達與多種腫瘤的發(fā)生、轉移有關，消減雜交也提示S100A2為腫瘤抑制因子；但也有相反報道。 S100A6蛋白最初由Kuznicki和Filipek在Ehrli

3、ch腹水瘤中檢出。它在多數上皮腫瘤(如黑色素瘤、肝癌、結直腸腫瘤、胰腺癌、膽管癌)、多數骨肉瘤、卵巢癌、ras轉化的MIH3T3細胞、SV4O轉化的鼠成纖維細胞和人急性粒細胞白血病等許多腫瘤中高表達，但它與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系尚不明確。 為了進一步探討S100A2和S100A6對腫瘤細胞的作用及其可能的機制，本課題擬通過重組蛋白直接作用的方式和/或腺病毒轉入基因的方式，研究人S100A2和S100A6對人結腸癌細胞株HCT116和

4、人骨肉瘤細胞株MG63細胞的增殖、遷移、細胞周期和凋亡等的影響，并對其作用機制進行初步探討。希望能夠為闡明S100A2和S100A6對腫瘤細胞的生物學作用及其機制提供實驗依據，為發(fā)現腫瘤診斷和預后判斷的新標志物以及腫瘤治療的新靶點奠定基礎。 方法： 1．hS100A2和hS100A6蛋白的鑒定和制備：雙酶切鑒定pGST-Moluc-hS100A2和pGST-Moluc-hS100A6后，將二者轉化大腸桿菌BL21，異丙基

5、-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導S100A2和S100A6蛋白表達，谷胱甘肽-瓊脂糖4B球珠(Glutathione Sepharose 4B beads)分離純化、十二烷基磺酸鈉．聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和Western blot鑒定這兩種重組蛋白，Bradford法定量，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?

6、 2．利用HEK293細胞擴增攜帶S100A6基因的重組腺病毒(ADS100A6)，并用SDS-PAGE/Western blot鑒定在感染了AdS100A6的HCT116中S100A6的表達。 3．GST(谷胱甘肽-S-轉移酶)、GST-hS100A2、GST-hS100A6、表達GFP的重組腺病毒(AdGFP)、AdS100A6分別作用人結腸癌細胞株HCT116和人骨肉瘤細胞株MG63后(其中，蛋白終濃度為40μg/ml)

7、，分別用MTT法和臺盼蘭染色/細胞計數法檢測HCT116和MG63細胞的增殖情況；流式細胞術檢測細胞周期改變(PI染色)和凋亡的發(fā)生(AnnexinV-PE+細胞活性檢測試劑7AAD)；Transwell小室檢測細胞的遷移能力；激光共聚焦技術觀察細胞內μ-catenin的變化。 結果 1．XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切pGST-Moluc-hS100A2和pGST-Moluc-hS100A6后，均出現約300bp和9kb的片

8、段，與其限制性內切圖譜相符；誘導表達、分離純化后的重組蛋白經過SDS-PAGE/Western blot鑒定，分別出現相應的陽性雜交條帶。表明這兩個表達質粒構建正確，能表達出相應蛋白hS100A2和hS100A6；Bradford法蛋白定量，計算出hS100A2和hS100A6的獲率分別為5mg/L菌液和3mg/L菌液。 2．在感染了AdS100A6的HCT116裂解液中，用SDS-PAGE/Western blot法檢測到hS

9、100A6的存在。表明AdS100A6攜帶的hS100A6基因能夠正常表達。 3．外源性S100A2和S100A6對細胞增殖的影響hS100A2和hS100A6分別作用HCT116時，hS100A2的重組蛋白組于第4天始出現細胞增殖抑制，與GST組的差異有顯著性(P<0.05)：hS100A6重組蛋白組于第5天出現增殖抑制(P<0.05)，AdS100A6組于第2天起，細胞數相對減少，與對照AdGFP組的差異有顯著性(P<0.0

10、5)。即hS100A6的重組蛋白和AdS100A6兩種作用方式均顯示出對HCT116細胞增殖的抑制作用。 4．外源性S100A2和S100A6對細胞周期的影響：hS100A2和hS100A6分別作用HCT116后72h：hS100A2蛋白組的G0-G1期和S期的細胞分別是GST組的121％和58％，差異均具有顯著性(P<0.05)；hS100A6蛋白組的G0-G1期和S期的細胞分別是GST組的118％和67％，差異均具有顯著性(

11、P<0.05)；AdS100A6組的G1-G1期和S期的細胞分別是AdGFP組的134％(P<0.05)和59％(P>0.05)，S期呈降低的趨勢。 5．外源性S100A2和S100A6對HCT116凋亡的影響：hS100A2和hS100A6重組蛋白作用HCT116細胞48h時，凋亡率分別是對照組的2-3倍和2.0倍，差異顯著(P<0.05)；AdS100A6組的凋亡率是對照組的1.13倍，呈增加趨勢。提示hS100A2和hS1

12、00A6有促進HCT116細胞凋亡的作用；S100A6以重組蛋白直接作用與基因轉入的方式對細胞凋亡的作用一致。 6．外源性S100A2和S100A6對細胞遷移能力的影響：hS100A2重組蛋白分別作用HCT116和MG63細胞60h后，穿過膜的細胞數分別較各自對照組減少75％和83％，差異均具有顯著性(P<0.01)。提示hS100A2對HCT116和MG63細胞有較強的遷移抑制作用。 hS100A6重組蛋白分別作用HC

13、T116和MG63細胞60h后，其穿過膜的細胞數分別較各自對照組減少14％和 33％；AdS100A6組(48h)分別較各自對照組減少56％和37％，差異均有顯著性(P<0.01)。提示hS100A6能明顯抑制HCT116和MG63細胞的遷移，其重組蛋白直接作用與基因轉入的方式對細胞遷移能力的作用一致。 7．兩種重組蛋白作用MG63后，免疫熒光染色，Leica ConfocalSoftware計算各組細胞的平均熒光強度：hS10

14、0A2組、hS100A6組分別是對照組的1.5和1.6倍，差異有顯著性(P<0.05)；激光共聚焦顯微鏡與透射光鏡下觀察：GST組的β-catenin主要位于胞漿中和核膜上，核內β-catenin集中呈現1～2個亮點，似聚集在核仁部位；細胞核膜完整，核仁1～2個；兩實驗組細胞內β-catenin的變化相似：胞漿β-catenin熒光著色增強，核內β-catenin也明顯增加，呈現3～4個亮點，似位于核仁；但是，原來位于核膜上的β-cat

15、enin明顯減少甚至消失，并且細胞核膜欠完整，多數細胞內的核仁為3～4個。 結論： 1．S100A2和S100A6能一定程度地抑制人結腸癌細胞株HCT116和人骨肉瘤細胞株MG63的增殖、改變其細胞周期分布(G0-G1期細胞增加，S期細胞減少)和促進細胞凋亡；其中，對細胞周期和細胞凋亡的作用可能參與了S100A2和S100A6對細胞增殖的抑制。 2．S100A2和S100A6能較明顯地抑制人結腸癌細胞株HCT11

16、6和人骨肉瘤細胞株MG63的運動遷移能力，其中S100A2的作用更強。 3．S100A2和S100A6能增加骨肉瘤細胞株MG63細胞內β-catenin的總含量，并改變其分布，最終表現為胞漿和胞核內β-catenin表達增加，核膜上的表達明顯減少，胞核中的表達似聚集在核仁。 4．外源性S100A6以重組蛋白直接作用的方式與以基因轉入的方式均有同樣活性。提示S100A6是又一個能夠在細胞外發(fā)揮作用的S100家族成員；如用于

17、臨床目的，兩種作用方式均適用。 本課題通過MTT法或臺盼蘭/細胞計數法、流式細胞術、Transwell小室探討了S100A2和S100A6作用于人結腸癌細胞株HCT116和人骨肉瘤細胞株MG63后細胞增殖能力、細胞周期、凋亡和遷移能力的變化，并用激光共聚焦技術探討了細胞內β-catenin的變化，發(fā)現S100A2和S100A6能夠一定程度地抑制HCT116和MG63的增殖、阻滯細胞周期和促進凋亡，后二者可能是其抑制細胞增殖的部分