沉默Twist基因?qū)CT116細胞株體外增殖及侵襲性影響的研究.pdf

1、目的：結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是我國常見的消化道惡性腫瘤，且發(fā)病率及死亡率均呈明顯上升趨勢。結(jié)直腸癌的發(fā)病是一個多因素、多步驟的過程，形成不同病理階段的相應(yīng)表型。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是正常的細胞在受到包括生物、物理、化學(xué)等各種外界因素作用后發(fā)生一系列分子水平變化，最終導(dǎo)致表型變化，成為腫瘤。腫瘤的發(fā)生，也是細胞增殖與細胞凋亡平衡失調(diào)的結(jié)果。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與細胞凋亡有密切的關(guān)系。在對細胞凋亡機制的研究中，人們

2、發(fā)現(xiàn)，堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白(basic helix-loop-helix bHLH)家族中高度保守的Twist基因不僅具有癌基因的特性，而且能通過多種途徑抑制細胞凋亡過程，促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生及血管的形成，同時也導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究表明，Twist過高表達于各種實體瘤中（包括乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤以及骨肉瘤），能夠促進人乳腺癌和黑色素瘤細胞系的凋亡。也有研究證實，Twist在人類乳腺癌MCF-7細胞株、結(jié)腸癌H

3、CT116細胞株、腎癌786-0細胞株、胃癌MNK細胞株、肝癌HepG2細胞株、正常肝細胞LO2等6種細胞系中，在結(jié)腸癌HCT116細胞系中的表達最高，而在正常肝臟細胞L02中的表達最低。而我們之前的研究也表明在HCT116，SW480，SW620三種結(jié)腸癌細胞系中，Twist基因在HCT116細胞系中表達最高。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)上調(diào)Twist基因的表達，會增強人結(jié)腸癌SW480細胞株體外增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力。本研究通過下調(diào)Twist基

4、因的表達，觀察對人結(jié)腸癌HCT116細胞株體外增殖及侵襲性的影響，進一步確定Twist基因與結(jié)直腸癌發(fā)生，發(fā)展的關(guān)系。
　　 方法：本研究將Twist SiRNA干擾質(zhì)粒和空載質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入Twist高表達結(jié)腸癌細胞系HCT116中，分別做為干擾組和對照組，通過G418篩選，經(jīng)過RT-PCR和Western-blot方法鑒定，觀察Twist SiRNA是否成功沉默結(jié)腸癌HCT116細胞株中Twist基因的表達，再通過MTT法測定

5、并繪制干擾組和對照組細胞的生長曲線，然后通過細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗，觀察Twist基因?qū)毎w移和侵襲能力的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示：干擾組細胞Twist基因的表達水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)．
　　 2.通過MTT法繪制細胞生長曲線，結(jié)果顯示，從第4天開始，干擾組細胞生長速度明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.

6、05）。
　　 3.通過細胞劃痕實驗顯示，劃痕24小時后對照組細胞遷移了(25.24±1.65)％，而干擾組細胞遷移了(15.06±2.56)％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。48小時后，對照組細胞遷移了(45.37±6.79)％，而干擾組遷移了(25.77±4.06)％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.體外侵襲實驗結(jié)果顯示，對照組細胞發(fā)生侵襲的個數(shù)為(123±20)，干擾組細胞侵襲個數(shù)為(68±18)，差異有統(tǒng)計學(xué)意

7、義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.采用本實驗方法可以成功沉默人結(jié)腸癌HCT116細胞株中Twist基因的表達。
　　 2.沉默Twist基因表達后，HCT116細胞體外增殖率明顯下降，說明Twist基因能夠影響HCT116細胞的體外增殖能力。
　　 3.沉默Twist基因表達后，HCT116細胞體外遷移能力明顯下降，說明Twist基因能夠影響HCT116細胞的遷移能力。
　　 4.沉默