缺血或感染因素對少突膠質細胞前體的毒性作用及姜黃素對毒性作用的體內外阻斷研究.pdf

1、腦室周圍白質軟化(periventricular leukomalacia,PVL)是目前早產(chǎn)兒腦損傷的最主要類型,為早產(chǎn)兒死亡和其后發(fā)生腦癱和認知行為障礙的主要因為。腦室周圍白質主要由髓鞘構成細胞-少突膠質細胞(Oligodendrocyte,OL)所構成。OL由前體細胞發(fā)育而來,歷經(jīng)OL前體、不成熟OL以及成熟OL幾個階段。研究表明,在胎齡23～32周,OL前體大量出現(xiàn)于腦室周圍白質內,對自由基攻擊具有明顯易損性,因而OL前體被公認

2、為是PVL病變的主要靶細胞,在早產(chǎn)兒PVL的發(fā)病機理中起著關鍵作用。缺血學說和感染學說是目前詮釋早產(chǎn)兒PVL發(fā)病機理相并列的兩大學說,缺氧缺血可導致反應性氧自由基(ROS)生成顯著增加,在OL前體對自由基攻擊內在易損性基礎上,ROS通過脂質過氧化、蛋白氧化和DNA損傷等途徑,導致OL前體死亡。感染/炎癥誘導小膠質細胞的激活,是感染型PVL發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。激活的小膠質細胞介導大量活性氧和活性氮的生成,尤其由NO和O2-·反應后所生成的

3、過氧亞硝酸鹽(Peroxynitrite,ONOO-),被認為是導致OL前體死亡的主要毒性因子。不論是缺血性因素抑或是感染性因素,其最終的病理改變均為腦室周圍白質OL前體的受損和丟失,而缺血或感染/炎癥時產(chǎn)生的大量自由基所介導的OL前體損傷,則可能是PVL發(fā)生發(fā)展的最終共同通路。迄今對PVL防治尚無有效方法。姜黃素是一種從中藥姜黃中提取的酚類物質,具有很強的抗氧化和抗炎癥反應作用,可減少自由基的生成和促進自由基的清除,還能減少各種炎癥介

4、質的合成和分泌,減少組織細胞氧化性和炎癥性損傷。研究表明,姜黃素對缺氧缺血或內毒素引起的肝、心、腎、腦等損害有一定的保護作用,但有關其在PVL中的作用及機制研究尚無報導。
　　 在國家自然科學基金和上海市教委基金的資助下,本課題首先對少突膠質細胞抗氧化損傷能力的成熟依賴性進行研究,在此基礎上,從缺血因素和感染因素的角度,分別從細胞和在體兩個層面,探討缺血因素和感染因素對OL前體的毒性作用,以及姜黃素對毒性作用的體內外阻斷效果,藉

5、以闡明姜黃素對OL前體的可能保護作用及其內在機制,為今后對早產(chǎn)兒PVL成功防治探索可行性途經(jīng)。
　　 第一部分少突膠質細胞抗氧化損傷能力的成熟依賴性研究
　　 取SD新生大鼠腦組織分別進行體外OL前體和成熟OL培養(yǎng),探討OL抗氧化損傷能力的成熟依賴性。顯示在相同H2O2濃度刺激下,OL前體的細胞活力明顯低于成熟OL。OL前體的抗氧化物質T-SOD、GSH-Px和CAT活力及GSH含量均明顯低于成熟OL,氧化物質MDA含量

6、則顯著高于成熟OL。OL前體的促凋亡基因產(chǎn)物Bax和Caspase-3的合成量均明顯高于成熟OL,抗凋亡基因產(chǎn)物Bcl-2的含量則顯著低于成熟OL,OL前體的Bcl-2/Bax比例亦明顯低于成熟OL。上述結果提示,OL對自由基攻擊存在成熟依賴性,OL前體的抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)育不完善以及Bcl-2/Bax比例的差異,是導致OL前體對自由基的處理能力低下、對自由基攻擊易損的重要因為。
　　 第二部份缺血因素對OL前體的毒性作用及姜黃素對

7、毒性作用的體外阻斷研究
　　 以H2O2損傷OL前體作為氧化應激損傷模型,探討對OL前體的毒性作用及姜黃素對毒性作用的體外阻斷研究。顯示對培養(yǎng)OL前體應用100μmol/L H2O2刺激,OL前體的活力降至正常對照組的52.7％；凋亡細胞數(shù)明顯增高；氧化物質MDA含量顯著上升,抗氧化物質SOD、GPx和CAT的活性顯著降低,GSH含量明顯減少；促凋亡蛋白Bax以及活化型caspase-3、9的顯著增加以及抗凋亡蛋白Bcl-2表達

8、顯著降低。應用10μg/ml姜黃素則可明顯提高OL前體的細胞活力至98.1％；明顯抑制H2O2誘導的細胞凋亡；顯著增加SOD、GPx和CAT的活性,提升GSH含量以及降低MDA濃度；并明顯上調Bcl-2的表達以及抑制H2O2誘導的Bax表達及caspase-3、9的活化增加,提高Bcl-2/Bax的比例。上述結果提示,姜黃素對OL前體氧化損傷的保護作用,與減輕OL前體的脂質過氧化、提高Bcl-2/Bax的比例以及抑制caspases的活

9、化,從而增強OL前體的抗氧化能力、抑制由H2O2誘導的OL前體凋亡。
　　 第三部份缺血因素對OL前體的毒性作用及姜黃素對毒性作用的體內阻斷研究
　　 對2日齡缺血型PVL新生大鼠在PVL前和PVL后即刻應用姜黃素50mg/kg.d,從體內評估姜黃素的腦保護效果。腦病理顯示兩個用藥組的腦白質病變較PVL組明顯改善,其中重度白質病變的發(fā)生率分別較PVL組降低了62.5％和43.8％,另有12.5％的腦白質完全正常；免疫組化

10、顯示用藥組腦內的O4和MBP染色的IOD值均較PVL組非常顯著地增高；并非常明顯地抑制由缺氧缺血引起的SOD、GPx和CAT活性的下降、GSH含量的減少,以及MDA含量的升高:用藥組的Bcl-2合成量亦較PVL組明顯增加,Bax以及caspases-3、9活化片段的合成量均較PVL組明顯減少。上述結果提示,姜黃素對缺氧缺血的腦白質保護作用,與其調節(jié)腦內的抗氧化系統(tǒng)、以及調節(jié)腦內的凋亡相關蛋白的表達有關,從而可顯著減輕缺氧缺血引起的OL的

11、丟失,對PVL新生大鼠腦白質損傷起保護作用。
　　 第四部份感染因素對OL前體的毒性作用及姜黃素對毒性作用的體外阻斷研究
　　 建立小膠質細胞與OL前體共培養(yǎng)模型,探討LPS對OL前體的毒性作用及姜黃素對毒性作用的體外阻斷研究。結果顯示LPS對單純培養(yǎng)的OL前體并無直接毒性,在小膠質細胞與OL前體共存時,LPS誘導小膠質細胞激活,從而介導OL前體凋亡。姜黃素能抑制LPS誘導的OL前體細胞凋亡。LPS刺激使小膠質細胞NO、

12、O2-·的生成量均顯著增加,iNOS的基因表達及其產(chǎn)物iNOS的含量均較對照組非常顯著升高,NAO亞基胞膜gp91-phox和p67-phox的表達亦較對照組非常明顯增加。應用10μg/ml姜黃素,小膠質細胞的NO、O2-·的生成量均明顯減少,iNOS基因的mRNA和蛋白表達均較LPS組非常顯著降低,NAO亞基胞膜gp91-phox和p67-phox的合成亦較LPS組顯著減少。上述結果提示,姜黃素對OL前體的保護作用,主要通過抑制LPS

13、誘導小膠質細胞內iNOS的表達和NAO活化,從而減少其產(chǎn)物NO和O2-·的產(chǎn)生,起到保護OL前體的作用。
　　 第五部份感染因素對OL前體的毒性作用及姜黃素對毒性作用的體內阻斷研究
　　 對2日齡感染型PVL新生大鼠在PVL前和PVL后即刻應用姜黃素50mg/kg.d,從體內評估姜黃素的腦保護效果。腦病理顯示兩個用藥組的腦白質病變較PVL組明顯改善,其中重度白質病變的發(fā)生率分別較PVL組降低了25％和18.7％,另有31

14、.3％和34.4％的腦白質完全正常；免疫組化顯示用藥組腦內的O4和MBP染色的IOD值均較PVL組顯著增高；IB4免疫熒光標記顯示腦內激活的小膠質細胞數(shù)明顯少于PVL組；腦內NO含量和O2-·的生成能力均明顯降低；腦內iNOS的基因表達及其產(chǎn)物iNOS的合成量均較PVL組非常顯著減低；腦內NAO亞基胞膜gp91-phox和p67-phox的合成亦較PVL組非常顯著減少。上述結果與體外研究結果一致,提示姜黃素對LPS誘導的感染型PVL的腦

15、白質保護作用,主要與抑制了腦內iNOS和NAO的活化,從而減少NO和O2-·的大量生成有關。
　　 通過上述缺血或感染因素對少突膠質細胞前體的毒性作用、以及姜黃素對毒性作用的體內體外阻斷系列研究,初步闡明了缺氧缺血氧化應激以及LPS誘導小膠質細胞激活導致OL前體死亡的相關機理,初步探討了姜黃素對OL前體的可能保護作用及其內在機制,尤其證實姜黃素在阻斷缺氧缺血、感染/炎癥導致OL前體死亡的相當有效性,可望為今后對早產(chǎn)兒PVL的成功