姜黃素對Aβ-,25-35-誘導的PC12細胞毒性的保護作用及其機制研究.pdf

1、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease, AD）是一種在老年期常見的神經(jīng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為進行性記憶、認知功能減退和精神障礙。AD的主要病理特征是在基底前腦、海馬和大腦皮層部位細胞外的老年斑（senile plaques，SP）和細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFT），并伴有突觸和神經(jīng)元的缺失。 Β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein, Aβ）是構(gòu)成AD特

2、征性病理改變老年斑的核心成分。大量研究證實Aβ尤其是聚合成纖維形式的Aβ對體外培養(yǎng)的神經(jīng)細胞及在體神經(jīng)細胞有毒性作用，主要毒性片段為Aβ25-35，表現(xiàn)在破壞細胞膜的完整性、擾亂細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及觸發(fā)氧化應(yīng)激、誘導細胞發(fā)生凋亡等方面。神經(jīng)病理學研究表明，AD患者腦中神經(jīng)元的凋亡率比正常人高30-50倍，細胞凋亡在AD發(fā)病中具有重要作用，是AD神經(jīng)元喪失的原因之一。因此，探求可以有效對抗Aβ25-35神經(jīng)毒性的藥物對于AD的治療是非常必

3、須的。 姜黃素（Curcumin）是從姜黃中提取得到的主要有效成分，一直作為食品添加劑為人們所普遍利用。大量研究發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等生理和藥理作用。近年來，姜黃素對于AD的研究越來越受到人們的關(guān)注，但具體機制尚不明確。 本課題在此基礎(chǔ)上建立Aβ25-35誘導PC12細胞損傷模型，同時應(yīng)用姜黃素對其進行干預(yù)，觀察其拮抗Aβ25-35的毒性的保護作用及其可能的機制。 本課題分兩部分。

4、 第一部分：研究Aβ25-35對PC12細胞的神經(jīng)毒性作用。 選用Aβ25-35 誘導的PC12細胞作為AD的細胞模型，四甲基偶氮唑鹽（MTT）法測定不同濃度Aβ25-35對PC12細胞活力的影響，應(yīng)用Annexin V-PI染色通過流式細胞儀、熒光顯微鏡檢測細胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，顯微鏡下觀察正常對照組PC12細胞體積較大，神經(jīng)突起明顯且長，細胞生長快，密度大，細胞貼壁能力強。加入Aβ25-35 24h后，細胞數(shù)量減少，體積變小，

5、突起減少變短，細胞貼壁能力減弱，隨著Aβ25-35劑量的加大，細胞明顯變小變圓，突起漸消失。MTT活性測定顯示隨著Aβ25-35濃度的增加，細胞活性逐漸下降，在Aβ25-35為20μmol/L時細胞活力開始明顯下降（P<0.01），隨著劑量逐漸加大，細胞活性進一步降低，呈劑量依賴，各濃度組之間均有統(tǒng)計學顯著性差異（P<0.05）。Annexin-V/PI染色后熒光顯微鏡觀察到Aβ25-35處理過的PC12細胞出現(xiàn)典型的細胞凋亡征象，早期

6、的凋亡細胞只出現(xiàn)細胞膜染色而細胞核未被染色，晚期的凋亡細胞則細胞膜和細胞核同時染色。 第二部分：姜黃素拮抗Aβ25-35對PC12細胞的毒性作用及其可能的機制。 選用PC12細胞，給予合適濃度的Aβ25-35和姜黃素，通過MTT，流式細胞儀，熒光顯微鏡、Western Blot等方法檢測細胞凋亡的變化。結(jié)果顯示，在倒置顯微鏡下觀察到20μmol/L Aβ25-35處理組細胞形態(tài)與正常組比較，細胞體積變小，突起減少變短，細

7、胞貼壁能力減弱，而經(jīng)過5μmol/L姜黃素處理后，細胞形態(tài)逐漸變大，突起也有恢復(fù)，細胞貼壁能力也增強。MTT結(jié)果顯示姜黃素具有拮抗Aβ25-35毒性的作用，在姜黃素濃度為5μmol/L細胞活力最高（P<0.01），隨著劑量逐漸加大，細胞活性開始降低，表明姜黃素在一定劑量范圍具有保護作用。熒光顯微鏡下觀察，正常組幾乎沒有凋亡細胞，偶見零星散在的早期凋亡細胞，即細胞膜染成綠色環(huán)狀而細胞核未被染色；經(jīng)20μmol/L Aβ25-35處理過的P

8、C12細胞則出現(xiàn)較多典型的細胞凋亡征象，不僅可見早期凋亡細胞同時可見晚期的凋亡細胞，即胞膜和胞核同時染色，細胞膜染成綠色環(huán)狀，胞核染成紅色；而經(jīng)5μmol/L姜黃素同時處理的PC12細胞凋亡細胞數(shù)目明顯減少。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示Aβ25-35處理組的細胞凋亡率明顯增高，與正常細胞相比有統(tǒng)計學意義，P<0.01；而姜黃素處理組細胞凋亡率有明顯的下降，與Aβ25-35處理組相比有統(tǒng)計學意義，P<0.01。表明姜黃素可以保護PC12細胞，使細胞

9、的凋亡率明顯下降。線粒體膜電位的測定結(jié)果表明，正常情況下，由于線粒體膜電位高，JC-1聚集發(fā)出紅色熒光；用20μmol/L Aβ25-35處理后，PC12細胞線粒體膜受損，JC-1進入減少，正常的紅色熒光逐漸被單體的綠色熒光代替，且細胞形態(tài)也發(fā)生變化；姜黃素處理組細胞雖然形態(tài)未恢復(fù)正常的狀態(tài)，但紅色熒光明顯比Aβ25-35處理組濃度高。表明姜黃組處理組的線粒體膜電位較Aβ25-35處理組有明顯恢復(fù)，提示姜黃素可拮抗Aβ25-35所致的氧

10、化應(yīng)激的增加，保護線粒體膜，減少其損傷。 對caspase-3和p-JNK的檢測結(jié)果顯示，經(jīng)過Aβ25-35處理的細胞與正常細胞比，caspase-3前體蛋白明顯減少，p-JNK表達增高，與正常細胞比較有統(tǒng)計學意義，P<0.01；而經(jīng)過姜黃素同時處理的PC12細胞，caspase-3前體蛋白表達高于Aβ25-35處理組，p-JNK表達低于Aβ25-35處理組，與Aβ25-35處理組比較有統(tǒng)計學意義，P<0.01，表明在Aβ25-

11、35的作用下，PC12細胞發(fā)生凋亡，其與caspase-3蛋白和p-JNK的表達有關(guān)，而姜黃素處理可以抑制p-JNK的活化，減少caspase-3蛋白的降解，從而減少細胞凋亡，達到保護生存的目的。 上述結(jié)果表明： 1、Aβ25-35可以誘導體外培養(yǎng)的PC12細胞出現(xiàn)凋亡，主要表現(xiàn)為形態(tài)學和細胞凋亡率的變化。 2、姜黃素可拮抗Aβ25-35的毒性作用，提高Aβ誘導的PC12細胞的活性，降低Aβ誘導的PC12細胞