自噬改變在錳誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性中的作用.pdf

1、【背景】
　　錳是大量存在于地殼的自然元素，也是人體必需的一種微量元素。然而過量錳暴露是一種公認(rèn)的環(huán)境健康危險因素，可誘導(dǎo)多種神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，尤其是類似于帕金森?。≒arkinson’sdisease，PD）的錐體外系功能異常。環(huán)境錳污染及其帶來的健康問題是一個重要的公共衛(wèi)生問題。
　　自噬-溶酶體途徑（autophagy-lysosomepathway，ALP）是真核細(xì)胞降解蛋白質(zhì)及功能失調(diào)的細(xì)胞器的重要途徑，與泛素-蛋白酶

2、體途徑（ubiquitin-proteasomepathway，UPP）一起在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮著重要的作用。近年來的研究結(jié)果表明，ALP功能的異常在多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。ALP功能的下降將導(dǎo)致多種神經(jīng)毒性蛋白在神經(jīng)元的異常蓄積，并進一步導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變的加重。反之，過高的自噬水平也可導(dǎo)致神經(jīng)元的變性壞死，尤其是在一些神經(jīng)毒性物質(zhì)誘導(dǎo)的毒性過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。
　　【目的】
　　

3、通過建立錳中毒的細(xì)胞模型，探討錳對神經(jīng)元自噬水平的影響，并進一步研究自噬水平的改變在錳誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性過程中的作用。研究結(jié)果可望為進一步闡明錳神經(jīng)毒性的分子機制以及提出新的錳神經(jīng)毒性防護措施提供思路。
　　【方法】
　　1．利用PC12細(xì)胞建立錳誘導(dǎo)DA神經(jīng)元損傷的體外模型。
　　2．利用流式細(xì)胞術(shù)、MTT、LDH活性檢測等方法測定細(xì)胞活力及細(xì)胞毒性。
　　3．電鏡、免疫熒光染色、WesternBlot等方式檢測自

4、噬水平的改變。
　　4．WesternBlot技術(shù)檢測自噬相關(guān)底物α-synuclein表達水平的改變。
　　【結(jié)果】
　　1．錳中毒體外模型的建立
　　MTT實驗結(jié)果顯示錳作用相同時間，隨著作用濃度的增高，細(xì)胞活力逐漸下降。LDH活性檢測結(jié)果顯示，PC12細(xì)胞的損傷程度逐漸隨著錳作用濃度的增高而加重。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，錳作用后，細(xì)胞死亡率隨錳作用濃度的增高而增高。
　　2．錳可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞自噬水

5、平的改變
　　在誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的同時，錳誘導(dǎo)自噬水平的改變。電鏡結(jié)果顯示，300μmol/L錳作用24h后出現(xiàn)典型的自噬超微結(jié)構(gòu)的改變。MDC染色以及EGFP-LC3轉(zhuǎn)染均可觀察到典型的自噬形態(tài)學(xué)改變。而WesternBlot結(jié)果顯示微管相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I的值以及自噬相關(guān)基因Beclin1的表達在300μmol/L的錳作用12h、24h均呈增高趨勢。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，錳誘導(dǎo)的自噬水平的改變主要是由于自噬體生成的增多而溶

6、酶體降解功能的異常。自噬抑制劑3-MA可使染錳PC12細(xì)胞內(nèi)的自噬囊泡（Avs）顯著減少；而溶酶體抑制劑Leu則由于抑制了溶酶體的降解功能而使自噬體數(shù)量增多。
　　3．自噬在錳誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷中作用的初步探討
　　MTT、LDH以及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，自噬增強劑可緩和錳誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞增殖活力下降、LDH的釋放以及死亡率的增高，而自噬抑制劑則加劇錳誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷；反之，自噬增強劑可抑制錳誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。同時，錳可

7、誘導(dǎo)α-synuclein表達水平的增高，而增強自噬可抑制其表達；反之，抑制自噬則促進α-synuclein的過表達。
　　【結(jié)論】
　　1．在誘導(dǎo)PC12細(xì)胞增殖抑制、損傷以及死亡率增高的同時，錳可以誘導(dǎo)自噬水平增高。
　　2.在錳誘導(dǎo)的自噬水平改變的過程中，自噬體生成的增多而非溶酶體降解功能的下降發(fā)揮了主要的作用。
　　3．錳誘導(dǎo)的自噬水平增高可能是一種代償性的保護效應(yīng)，抑制自噬可增強其毒性損傷效應(yīng)，而增強自

8、噬則可抑制錳誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。
　　4.促進自噬后，染錳組α-synuclein表達水平有所降低，而抑制自噬水平后α-synuclein表達增高的現(xiàn)象更加明顯。結(jié)合以往的研究結(jié)果，我們推測，增強和抑制自噬對錳誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性的影響可能與異常蓄積α-synuclein降解有一定的相關(guān)性。
　　綜上所述，本研究初步闡明了錳對多巴胺能神經(jīng)元自噬水平的影響及其在錳誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中的作用，結(jié)果將為進一步闡明錳神經(jīng)毒性的分子機制以