氯通道阻滯劑對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　阿爾茨海默?。ˋlzheimer Disease，AD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性、退行性疾病，是老年期癡呆最常見的類型。其病理學(xué)特征是：出現(xiàn)在與學(xué)習(xí)、記憶相關(guān)的大腦皮層的老年斑(senile plaques，SP)、神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元的缺失。β淀粉樣多肽﹙βamyloid pepitide,Aβ﹚形成的絲狀沉淀是SP的重要組成成分。雖然大量的研究表明Aβ有細(xì)胞毒性作用，可以引起細(xì)胞的壞死和凋亡，但其細(xì)胞損傷機制至

2、今尚不清楚。
　　陰離子的自穩(wěn)態(tài)在凋亡過程的作用受到了日益廣泛的重視。氯離子作為細(xì)胞內(nèi)的優(yōu)勢陰離子,在細(xì)胞容積調(diào)節(jié)及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。研究表明，氯通道激活，細(xì)胞內(nèi)氯離子外流，引起凋亡性細(xì)胞容積減?。╝poptotic volume decrease，AVD），最后導(dǎo)致凋亡事件的發(fā)生，氯通道阻滯劑可以抑制AVD以及隨后的凋亡事件。
　　研究目的：
　　1．研究細(xì)胞色素C釋放和caspase3激活在Aβ25-35毒

3、性中的作用。
　　2．探討氯通道阻斷劑DIDS對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響。
　　研究方法：
　　本實驗采用大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞)作為研究對象，實驗分組：無任何干預(yù)的對照組、40μmol/LAβ25-35損傷組、40μmol/LAβ25-35+50μmol/LDIDS保護(hù)組。通過四甲基偶氮唑蘭代謝率測定檢測細(xì)胞存活率；利用光鏡Hoechst33258熒光染色技術(shù)來觀察細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；采用流

4、式細(xì)胞儀技術(shù)檢測早期凋亡率；應(yīng)用westernblot免疫印跡技術(shù)研究細(xì)胞色素C和caspase3的表達(dá)。
　　研究結(jié)果：
　　1．誘導(dǎo)Aβ25-35對PC12細(xì)胞凋亡作用的產(chǎn)生:
　?、匐S著Aβ25-35作用時間的延長，細(xì)胞存活率逐漸下降。
　　②Hoechst33258熒光染色結(jié)果顯示Aβ25-35組細(xì)胞核致密濃染,或呈碎塊狀致密濃染的DNA碎片,核膜皺縮,呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。
　?、哿魇郊?xì)胞技術(shù)

5、檢測Aβ25-35組早期細(xì)胞凋亡率為35.7％±6.1％，對照組1.5％±0.5％，P<0.05。
　　2．證實了DIDS對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用：
　?、費TT結(jié)果示細(xì)胞存活率增高與DIDS的劑量有關(guān)，呈現(xiàn)劑量依賴性遞增。
　?、跓晒馊旧椒◤男螒B(tài)學(xué)結(jié)果顯示氯通道阻斷劑DIDS能明顯抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡。流式細(xì)胞儀檢測顯示DIDS能明顯抑制Aβ25-35誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡，D

6、IDS組細(xì)胞凋亡率為5.6％±1.0％，顯著低于Aβ組，P<0.05。
　?、跘β干預(yù)PC12細(xì)胞6h開始細(xì)胞色素C表達(dá)增高，12h開始caspase3表達(dá)增強，DIDS干預(yù)后細(xì)胞色素C和caspase3的表達(dá)均受到明顯抑制。
　　研究結(jié)論：
　　1．Aβ25-35所致PC12細(xì)胞凋亡依賴線粒體-細(xì)胞色素C釋放途徑，繼而上調(diào)凋亡執(zhí)行蛋白分子caspase3，觸發(fā)細(xì)胞凋亡。
　　2．氯通道阻斷劑DIDS明顯下調(diào)Aβ