對LPS誘導(dǎo)OL前體死亡的體內(nèi)外阻斷研究.pdf

1、腦室周圍白質(zhì)軟化（PVL）是目前早產(chǎn)兒腦損傷的最主要類型，為早產(chǎn)兒死亡和其后發(fā)生腦癱和認(rèn)知行為障礙的主要原因。本研究在LPS誘導(dǎo)活性小膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致OL前體死亡的PVL感染學(xué)說基礎(chǔ)上，通過體內(nèi)外研究，確認(rèn)LPS誘導(dǎo)OL前體死亡的信號傳導(dǎo)通路，探索了LPS誘導(dǎo)MG激活的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，并探討了iNOS抑制劑1400W在LPS誘導(dǎo)OL前體死亡通路的阻斷效果。本研究分為兩個(gè)部分： 第一部分：LPS誘導(dǎo)活性MG對OL前體的毒性作用及阻斷毒性

2、作用的體外研究。⑴取2日齡SD新生大鼠腦組織，采用“改良振蕩伴差速貼壁”法以及“營養(yǎng)剝奪伴振蕩”法，分別成功獲取了大量純度高、活力好的OL前體和MG。免疫鑒定顯示，所培養(yǎng)的OL前體和MG純度分別達(dá)95％和90％以上。⑵應(yīng)用LPS誘導(dǎo)共培養(yǎng)OL前體和MG，顯示LPS可誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)iNOS表達(dá)明顯上調(diào)，NO、O2-及ONOO-生成顯著增加，OL前體死亡率增高。從體外確認(rèn)LPS誘導(dǎo)OL前體死亡的信號傳導(dǎo)通路，是由于LPS誘導(dǎo)MG激活，促使表

3、達(dá)iNOS和活化NADPH氧化酶，其產(chǎn)物NO和O2-大量生成，兩者進(jìn)一步反應(yīng)生成大量的毒性因子ONOO-，作用于OL前體，從而導(dǎo)致OL前體的死亡。⑶對TLR4基因缺失小鼠和野型小鼠進(jìn)行對照研究，進(jìn)一步探討LPS誘導(dǎo)MG激活的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。通過檢測TLR4基因及其產(chǎn)物TLR4蛋白，確認(rèn)所用實(shí)驗(yàn)小鼠確系TLR4基因缺失動(dòng)物。應(yīng)用LPS分別誘導(dǎo)TLR4基因缺失小鼠和野型小鼠的共培養(yǎng)OL前體和MG，顯示LPS誘導(dǎo)可引起野型小鼠培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)NO、O

4、NOO-含量明顯增加，OL前體凋亡率增高。 LPS的誘導(dǎo)對TLR4基因缺失小鼠培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)NO、ONOO-含量以及OL前體凋亡率則均無明顯影響。證實(shí)LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的跨模轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，以及導(dǎo)致OL前體死亡的信號傳導(dǎo)通路，必須依賴TLR4受體的介導(dǎo)。研究證實(shí)LPS可能通過其它非TLR4受體依賴途徑誘導(dǎo)NADPH氧化酶的活化和O2-的生成。⑷在確認(rèn)LPS誘導(dǎo)活性MG導(dǎo)致OL前體死亡通路的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討1400W對LPS誘導(dǎo)OL前體死亡

5、通路的體外阻斷效果。結(jié)果顯示，應(yīng)用1400W 10umol/L可顯著降低因LPS誘導(dǎo)而增高的iNOS合成量以及NO和ONOO-含量，并顯著提高了LPS誘導(dǎo)后OL前體的成活率。提示iNOS、NO以及ONOO-在LPS誘導(dǎo)OL前體死亡的信號傳導(dǎo)通路中扮演了重要角色，1400W通過選擇性抑制iNOS，減少NO及ONOO-的生成，從而有效阻斷了由LPS誘導(dǎo)活性MG對OL前體的毒性作用，提高了OL前體的存活率。從體外確認(rèn)1400W對LPS誘導(dǎo)OL

6、前體的死亡通路有明顯阻斷效果。 第二部分：LPS誘導(dǎo)活性MG對OL前體的毒性作用及阻斷毒性作用的體內(nèi)研究。⑴對2日齡新生大鼠在腦立體定位儀下經(jīng)側(cè)腦室注入LPS，于造模后第5天，光鏡下病理以及免疫組化分析顯示，LPS誘導(dǎo)引起新生大鼠腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)明顯的病理改變以及白質(zhì)內(nèi)OL前體的大量丟失，符合人類早產(chǎn)兒PVL的病理學(xué)特征。確認(rèn)經(jīng)腦室注入LPS可成功建立感染型PVL動(dòng)物模型，為下一步進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。⑵對感染型PVL新生大鼠進(jìn)行L

7、PS誘導(dǎo)活性MG對OL前體毒性作用的體內(nèi)確認(rèn)研究。顯示LPS誘導(dǎo)可引起新生大鼠明顯腦白質(zhì)損傷，腦內(nèi)iNOS表達(dá)明顯上調(diào)，NO和ONOO-含量顯著增加，腦白質(zhì)內(nèi)O4標(biāo)記的OL前體顯著較少。進(jìn)一步從體內(nèi)確認(rèn)LPS誘導(dǎo)OL前體的死亡通路，是通過LPS誘導(dǎo)MG激活，促使大量生成NO及ONOO-，作用于OL前體，從而導(dǎo)致OL前體死亡。⑶對感染型PVL新生大鼠分別在LPS注射后即刻、8h、16h及24h，經(jīng)皮下注射1400W 20mg/kg，探討1