EGb761對體內(nèi)外模擬“缺血微環(huán)境”誘導(dǎo)BMSCs凋亡的作用及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:體內(nèi)外模擬心肌梗死區(qū)缺血微環(huán)境,探討EGb761對移植BMSCs的影響及其作用機(jī)制。
　　 方法:應(yīng)用Ficoll液密度梯度離心法,分離大鼠BMSCs,并純化擴(kuò)增;體外通過缺氧無血清處理BMSCs3h、6h、9h、12h和24h建立缺血模型(94％N2+5％C02+1％02).Hochest33258染色檢測BMSCs核變化,流式細(xì)胞儀檢測BMSCs細(xì)胞凋亡率,選擇BMSCs凋亡最顯著的時(shí)間點(diǎn),實(shí)驗(yàn)分組如下:對照組、模型組

2、、EGb761組(10、50、100、500、1000和2000μg/ml)。缺氧無血清處理后,Hochest33258染色檢測BMSCs核變化,流式細(xì)胞儀檢測BMSCs細(xì)胞凋亡率,Western Blot檢測Procaspase-3蛋白的表達(dá),比色法檢測MDA的含量、SOD的活性。選擇EGb761對缺氧無血清誘導(dǎo)BMSCs凋亡最顯著的劑量Western Blot檢測Procaspase-8、Procaspase-9、Fas、Bcl-2

3、、Bax、Bad、P-Akt和T-Akt蛋白的表達(dá)。PI3K通路抑制劑Wrotmannin預(yù)處理1h后,流式細(xì)胞儀檢測BMSCs細(xì)胞凋亡率,Western Blot檢測Procaspase-3蛋白的表達(dá)。
　　 建立大鼠心肌梗死模型,經(jīng)心外膜下直接注射經(jīng)PKH-26標(biāo)記的SD大鼠BMSCs作為移植供體細(xì)胞(1×105cells)。將上述動(dòng)物隨機(jī)分為5組:對照組、25ml/kg/d EGb761組、50ml/kg/d EGb761

4、組、75ml/kg/d EGb761組100ml/kg/dEGb761組,每組5只,于術(shù)后7d取材。HE染色觀察心肌梗死區(qū)及邊緣區(qū)炎性細(xì)胞浸潤,Tunel法檢測梗死心肌中移植細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.缺氧無血清條件對細(xì)胞凋亡的影響。
　　 Hoechst33258染色結(jié)果顯示,缺氧前BMSCs細(xì)胞核染色均勻,發(fā)出藍(lán)色熒光;缺氧后BMSCs細(xì)胞核皺縮,發(fā)出高亮度的藍(lán)色熒光。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,與缺

5、氧無血清處理前相比,缺氧無血清處理后BMSc的凋亡率顯著增加,并隨著缺氧時(shí)間的延長,BMSCs的凋亡率逐漸升高。
　　 2.EGb761對缺氧無血清誘導(dǎo)BMSCs凋亡的影響。
　　 Hoechst33258染色結(jié)果顯示,正常對照組細(xì)胞核大而均質(zhì),發(fā)出淡藍(lán)色熒光;凋亡模型組(Hypoxia/SD)及低劑量EGb761(10、50、100μg/ml)組細(xì)胞核皺縮,發(fā)出高亮度的藍(lán)色熒光;而高劑量EGb761(500、1000、

6、2000μg/ml)組細(xì)胞核似正常對照組,核大而均質(zhì),淡藍(lán)染色。
　　 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,與缺氧模型組相比,低劑量EGB761(10、50μg/ml)組BMSCs凋亡率顯著增加,其中50μg/ml EGb761組BMSCs凋亡率增加最顯著;100μg/ml劑量組BMSCs凋亡率變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高劑量EGB761(500、1000、2000μg/ml)組BMSCs凋亡率顯著降低,其中1000μg/ml EGb761組BM

7、SCs凋亡率降低最顯著。Western blot檢測結(jié)果顯示,與正常對照組相比,缺氧無血清處理后caspase-3前體蛋白表達(dá)量明顯降低,與模型組相比,低劑量EGB761(10、50μg/ml)組Procaspase-3蛋白表達(dá)量顯著降低,其50ug/mlEGb761組Procaspase-3蛋白表達(dá)量降低最顯著;100μg/ml劑量組Procaspase-3蛋白表達(dá)量變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高劑量EGb761(500、1000、2000μ

8、g/ml)組Procaspase-3蛋白表達(dá)量顯著增加,其中1000μg/mlEGb761組增加最顯著。
　　 3.EGb761對缺氧無血清誘導(dǎo)BMSCs氧化應(yīng)激的影響
　　 EGb761處理后,BMSCs中SOD活力顯著增加,并隨EGb761濃度的增加逐漸增強(qiáng);EGb761處理后BMSCs中MDA含量顯著降低,并隨EGb761濃度的增加逐漸降低。
　　 4.EGb761對缺氧無血清誘導(dǎo)BMSCs中凋亡蛋白變化的

9、影響
　　 Western blot檢測結(jié)果顯示,EGb761處理后BMSCs的bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加并隨EGb761濃度的增加逐漸增強(qiáng);EGb761處理后bax蛋白表達(dá)顯著降低,并隨EGb761濃度的增加逐漸降低。與正常對照組相比,缺氧無血清處理后,Procaspase-8和Procaspase-9蛋白表達(dá)量明顯降低,Fas和Bad蛋白表達(dá)量顯著增加,Akt發(fā)生去磷酸化;與模型組比較,低劑量EGb761處理后,Procas

10、pase-9蛋白表達(dá)量明顯降低,Procaspase-8蛋白表達(dá)量未發(fā)生顯著變化,Fas和Bad蛋白表達(dá)量顯著增加,Akt發(fā)生去磷酸化;高劑量EGb761處理后,Procaspase-8和Procaspase-9蛋白表達(dá)量顯著增加,Fas和Bad蛋白表達(dá)量顯著降低,Akt發(fā)生磷酸化。加入PI3K-AKT通路抑制劑wortmannin預(yù)處理后,低劑量EGb761處理組Procaspase-3蛋白表達(dá)量進(jìn)一步降低,高劑量EGb761處理組P

11、rocaspase-3蛋白表達(dá)量降低。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,低劑量EGb761處理組BMSCs凋亡率進(jìn)一步增加,而高劑量EGb761處理組BMSCs凋亡率顯著降低。
　　 5.心肌梗死區(qū)移植的BMSCs凋亡比率測定
　　 結(jié)果與對照組比較,給予25mg/kg/d劑量EGb761組中移植的BMSCs凋亡比率增加;給予50mg/kg/d劑量EGb761組中移植的BMSCs凋亡比率無顯著變化;給予75mg/kg/d劑量EGb

12、761組和100mg/kg/d劑量EGb761組中移植的BMSCs凋亡比率顯著降低。
　　 結(jié)論:
　　 1.缺氧無血清聯(lián)合處理能較好的模擬模擬缺血心肌微環(huán)境,誘導(dǎo)BMSCs凋亡；
　　 2.EGb761對缺氧無血清聯(lián)合誘導(dǎo)BMSCs凋亡具有的雙重劑量依賴效應(yīng)；小劑量的EGb761可誘導(dǎo)的BMSCs凋亡,而大劑量的EGb761則抑制BMSCs凋亡,并且這種雙重劑量依賴效應(yīng)可能與Akt介導(dǎo)的線粒體信號通路相關(guān);