CXCL12對(duì)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的促增殖作用及其機(jī)制研究.pdf

1、脊髓損傷(Spinal Cord Injury, SCI)是以造成患者損傷平面以下所支配區(qū)域感覺、運(yùn)動(dòng)功能及排尿、排便功能異常為主要臨床表現(xiàn)的一種高發(fā)性、難治性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)和交通運(yùn)輸業(yè)的發(fā)展，SCI的發(fā)生率呈逐年增高趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，由此也給患者、家人、國家?guī)砹藝?yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前對(duì)于SCI的研究雖然取得了一些可喜成果，但是在實(shí)際的臨床工作中，SCI的治療效果仍不理想，SCI的治療仍是醫(yī)學(xué)界一個(gè)有待攻克

2、的難題?？梢?，開展SCI的治療研究是一個(gè)急迫且具有科學(xué)和社會(huì)意義的課題。
　　SCI是一個(gè)長(zhǎng)期的復(fù)雜的損傷過程:既包括受傷當(dāng)時(shí)的直接機(jī)械暴力本身對(duì)神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管等的離斷、破壞所引起的原發(fā)性損傷，又包括損傷后一段時(shí)間內(nèi)的炎癥反應(yīng)、組織水腫、組織缺氧、組織缺血、脂質(zhì)過氧化作用、谷氨酸受體過度激活、鈣離子超載通路激活等一系列因素導(dǎo)致的繼發(fā)性級(jí)聯(lián)損傷。SCI在直接導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的同時(shí)，還可引起少突膠質(zhì)細(xì)胞大量死亡，進(jìn)而導(dǎo)致

3、軸突脫髓鞘改變，嚴(yán)重影響機(jī)體各種神經(jīng)功能的發(fā)揮。
　　少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(Oligodendrocyte Precursor Cells，OPCs)是少突膠質(zhì)細(xì)胞系發(fā)育的起始細(xì)胞，是還未成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞。一方面，OPCs具較強(qiáng)的增殖能力，能夠在體內(nèi)快速增殖;另一方面，OPCs能在特定信號(hào)因子的作用下定向遷移，最終分化為成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞，包繞軸突形成髓鞘。已有相關(guān)研究結(jié)果表明:通過OPCs細(xì)胞移植，OPCs能夠在體內(nèi)存活，促進(jìn)髓鞘形

4、成，最終明顯改善SCI大鼠的運(yùn)動(dòng)、神經(jīng)功能。
　　趨化因子除了早期發(fā)現(xiàn)的對(duì)炎癥細(xì)胞、骨髓細(xì)胞起傳統(tǒng)的趨化作用外，現(xiàn)在還發(fā)現(xiàn)在胚胎期中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，神經(jīng)損傷后的修復(fù)過程中均具有不同程度的作用。在正常生理?xiàng)l件下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)CXCL12/CXCR4，起著介導(dǎo)神經(jīng)元前體細(xì)胞向最終功能區(qū)域定向遷移的作用。在病理?xiàng)l件下，CXCL12/CXCR4分子更是與神經(jīng)系統(tǒng)損傷、修復(fù)過程密切相關(guān)。已有文獻(xiàn)報(bào)道:CXCL12對(duì)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜血管

5、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞及其前體細(xì)胞、初級(jí)小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)前體細(xì)胞等多種細(xì)胞增殖、分化等生長(zhǎng)均具有一定影響。也有發(fā)現(xiàn)CXCL12可以通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶3(Matrix Metalloproteinase3，MMP3)and基質(zhì)金屬蛋白酶9(MatrixMetalloproteinase9，MMP9)的表達(dá)變化來影響神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖和分化。因此，我們有理由推測(cè)CXCL12也有可能以類似的作用機(jī)制參與由神經(jīng)前體細(xì)胞分化而來的

6、OPCs增殖、分化過程的調(diào)控。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)擬行OPCs的分離純化，建立其體外培養(yǎng)模型，觀察其在體外生長(zhǎng)、增殖情況。探索CXCL12對(duì)OPCs增殖的影響，并檢測(cè)CXCR4、CXCR7、MMP9在其中的重要作用，以期更好的了解OPCs增殖、分化特性，為后期研究移植后的OPCs在體內(nèi)存活、增殖、分化調(diào)節(jié)，脫髓鞘軸突的再髓鞘化，軸突的再生，最終為脊髓損傷的治療奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.選用出生

7、48小時(shí)(hour，h)內(nèi)的SD大鼠，取大腦皮質(zhì)組織，用振蕩分離、差速貼壁等方法分離、純化、培養(yǎng)獲得OPCs。采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，根據(jù)早期OPCs細(xì)胞膜上特異性的表達(dá)PDGFR-α，行分離獲得的OPCs鑒定。將OPCs轉(zhuǎn)入定向分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間后，根據(jù)OPCs誘導(dǎo)中晚期O4、MBP表達(dá)，行少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟情況的鑒定。
　　2.體外條件下，用CCK-8法檢測(cè)OPCs在不同濃度的CXCL12(0ng/mL、5ng/mL、1

8、0ng/mL、20ng/mL)培養(yǎng)條件下，在不同時(shí)間點(diǎn)(0h、24h、48h、72h)的增殖情況。利用Western blot法檢測(cè)OPCs在不同濃度的CXCL12作用72h后下游CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表達(dá)。
　　3.在20ng/mL的CXCL12培養(yǎng)條件下，選用經(jīng)過篩選后能夠有效干擾OPCs的CXCR4、CXCR7表達(dá)的CXCR4 siRNA、CXCR7 siRNA分別干擾CXCR4、CXCR7蛋白表達(dá)。用CCK-

9、8檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組(CXCL12、CXCL12+con siRNA、CXCL12+CXCR4siRNA、CXCL12+CXCR7 siRNA) OPCs在不同時(shí)間點(diǎn)(0h、24h、48h、72h)的增殖情況，用Western blot法檢測(cè)OPCs各實(shí)驗(yàn)組條件下作用72h后CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表達(dá)情況。
　　4.利用經(jīng)過篩選后能夠有效干擾CXCR4、CXCR7下游的MMP9表達(dá)的MMP9siRNA干擾MMP9表達(dá)，然后

10、CCK-8檢測(cè)在20ng/mL的CXCL12條件下OPCs在各時(shí)間點(diǎn)(0h、24h、48h、72h)的增殖情況。
　　結(jié)果:
　　1.在原代培養(yǎng)第9-10天，細(xì)胞呈明顯分層生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，利用振蕩分離、差速貼壁方法獲得了大量高純度的OPCs。剛開始細(xì)胞胞體較小，直徑6～10μm，近似的呈圓形，為折光性較強(qiáng)的小亮點(diǎn)，有的胞體開始有細(xì)小的兩極細(xì)胞突起或者三極細(xì)胞突起出現(xiàn)。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示:分離后OPCs能特異性表達(dá)PDGFR-

11、α，定向分化培養(yǎng)后，OPCs趨于成熟，周圍纖細(xì)突起較未誘導(dǎo)前稍增多，細(xì)胞胞體增大，誘導(dǎo)中期O4表達(dá)呈陽性，誘導(dǎo)晚期胞體網(wǎng)狀纖細(xì)突起更加明顯，呈“樹枝狀”甚至“蜘蛛網(wǎng)狀”分布，MBP表達(dá)呈陽性，是成熟的髓鞘形成細(xì)胞。
　　2.在一定濃度范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基中CXCL12濃度增加，OPCs增殖作用逐漸增強(qiáng)，CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表達(dá)量逐漸增加;在一定范圍的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，OPCs增殖逐漸增強(qiáng)，CXCR4、C

12、XCR7、MMP9蛋白的表達(dá)量逐漸增加。與0ng/mL相比，20ng/mLCXCL12作用72h后，OPCs增殖及CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表達(dá)增加最明顯(P＜0.05)。
　　3.用CXCR4siRNA、CXCR7siRNA分別干擾CXCR4、CXCR7蛋白表達(dá)后，OPCs在各時(shí)間點(diǎn)的增殖均逐漸受到抑制，培養(yǎng)72h后差異最顯著(P＜0.05、P＜0.05)，CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表達(dá)量逐漸減少，培養(yǎng)72h

13、后差異最顯著(P＜0.05、P＜0.01)。
　　4.單獨(dú)用MMP9 siRNA干擾MMP9表達(dá)后，OPCs增殖同樣受到抑制，增殖作用降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.本實(shí)驗(yàn)通過振蕩分離、差速貼壁法分離獲得了實(shí)驗(yàn)所需的原代OPCs，在體外培養(yǎng)條件下可以繼續(xù)存活，分化成熟。
　　2.在一定的濃度和時(shí)間范圍內(nèi)，CXCL12能夠明顯促進(jìn)OPCs的增殖，這種促增殖作用與CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表達(dá)上