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文檔簡(jiǎn)介
1、神經(jīng)退行性疾病是一類慢性、進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的總稱。其發(fā)病率高、病期長(zhǎng)、并且缺乏特異性治療方法與措施。該類疾病給個(gè)人、家庭、社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)與社會(huì)負(fù)擔(dān)的雖然這類疾病的病變部位及原因各不相同,但髓鞘產(chǎn)生不同程度破壞或發(fā)生脫髓鞘病變是它們的共同點(diǎn)。主要表現(xiàn)為伴隨著少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocyte,OL)的減少以及脫髓鞘。雖然對(duì)于這類疾病有很多的研究,少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷和再生修復(fù)的的具體機(jī)制依然不清楚。
少突膠質(zhì)
2、細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)唯一的髓鞘形成細(xì)胞。其前體細(xì)胞-少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte progenitor cell,OPC)具有良好的增殖能力,能在體內(nèi)增殖、遷移,最后形成成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞,為髓鞘形成發(fā)揮極其重要的作用。無(wú)論內(nèi)源性誘導(dǎo)還是外源性移植,如何獲取大量的OPC,或者促進(jìn)OPC再生成為治療脫髓鞘疾病的關(guān)鍵。我們前期發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes,AST)與OPC在接觸共培養(yǎng)的條件下促進(jìn)其增殖,但具體調(diào)
3、控增殖的機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)探討了ASTs影響OPCs增殖的具體機(jī)制。為治療脫髓鞘疾病提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)與理論基礎(chǔ)。
本研究分為以下三個(gè)部分:
第一部分:星形膠質(zhì)細(xì)胞通過Cx47促進(jìn)OPCs增殖
本部分通過使用星形膠質(zhì)細(xì)胞與OPC不同的培養(yǎng)方式,利用細(xì)胞流式、EdU檢測(cè)細(xì)胞周期及增殖。采用二代測(cè)序分析了不同培養(yǎng)條件下所有的差異基因,篩選有效的差異基因Cx47。構(gòu)建有效的Cx47 siRNA,WB、PCR檢測(cè)
4、Cx47蛋白基因變化,細(xì)胞流式檢測(cè)細(xì)胞周期、EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
主要結(jié)果如下:
1.OPCs與ASTs直接接觸共培養(yǎng)后,光鏡、流式、EdU檢測(cè)顯示ASTs促進(jìn)OPCs增殖較單獨(dú)培養(yǎng)組與上清培養(yǎng)組更明顯,處于細(xì)胞周期S期細(xì)胞比例明顯增加(P<0.05),新生細(xì)胞數(shù)目占總細(xì)胞數(shù)比例顯著增加(P<0.001)。
2.OPCs與ASTs直接接觸共培養(yǎng)中,Cx47促進(jìn)了OPCs增殖。
3.干擾Cx47
5、后,Cx47蛋白與基因表達(dá)明顯下降(P<0.001),細(xì)胞周期阻滯(P<0.01),增殖能力降低(P<0.001)。
上述結(jié)果說明ASTs促進(jìn)OPCs的增殖可能通過直接接觸的Cx47。
第二部分:星形膠質(zhì)細(xì)胞通過Cx47促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞S1PR3表達(dá)誘導(dǎo)其增殖
在證實(shí)接觸共培養(yǎng)更能促進(jìn)OPCs增殖的前提下,我們進(jìn)一步比較了共培養(yǎng)與單獨(dú)培養(yǎng)條件下下游膜信號(hào)的變化,利用接觸式共培養(yǎng)組差異表達(dá)基因GO細(xì)胞組分
6、分析,顯示主要位于細(xì)胞外基質(zhì)、胞外區(qū)、細(xì)胞膜。以G-protein coupled receptor activity聚類分析顯示,在S1PRs家族中表達(dá)三個(gè)亞型,S1PR1、S1PR3、S1PR5,尤以S1PR3在接觸共培養(yǎng)組較單獨(dú)OPCs培養(yǎng)組差異性最為顯著。本部分在ASTs與OPCs接觸共培養(yǎng)與單獨(dú)培養(yǎng)的條件下,進(jìn)一步檢測(cè)了Cx47影響少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖的機(jī)制,流式、共聚焦檢測(cè)Cx47干擾后Ca2+的表達(dá),WB、PCR檢測(cè)下游的
7、S1PR3表達(dá),流式檢測(cè)細(xì)胞周期。EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。利用S1PR3的拮抗劑后,WB檢測(cè)了S1PR3,EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
主要結(jié)果如下:
1.Cx47干擾后,流式檢測(cè)Ca2+濃度下降(P<0.05),與共聚焦結(jié)果一致(P<0.001)。
2.下游受體信號(hào)的變化以 S1PRs家族在共培養(yǎng)與單獨(dú)培養(yǎng)差異最為顯著,尤以S1PR3最為明顯。
3.干擾Cx47后S1PR3的蛋白表達(dá)下降(P<0.0
8、01)、基因表達(dá)下降(P<0.01)。
4.拮抗S1PR3后,相比單獨(dú)培養(yǎng)組,在共培養(yǎng)組 OPCs細(xì)胞周期G1期阻滯(P<0.05),EdU檢測(cè)新生細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)比例下降(P<0.001)。
以上結(jié)果表明OPCs與ASTs接觸共培養(yǎng)中,Cx47觸發(fā)Ca2+內(nèi)流,上調(diào)S1PR3的表達(dá)調(diào)控OPCs的增殖。
第三部分:ASTs通過上調(diào)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞S1PR3激活ERK/p21通路誘導(dǎo)其增殖
本部分在
9、ASTs與OPCs接觸共培養(yǎng)與單獨(dú)培養(yǎng)的條件下,主要探討了Cx47調(diào)控S1PR3表達(dá)促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖的下游通路。S1PR3拮抗后,WB檢測(cè)了ERK1/2、p-ERK1/2、p21的蛋白變化。PCR檢測(cè)了Id4的變化。EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖。
主要結(jié)果如下:
1.S1PR3拮抗后,p-ERK1/2降低(P<0.001),p21表達(dá)增高(P<0.05),細(xì)胞增殖能力下降(P<0.001)。
2.ERK1/2
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