褪黑素緩釋制劑的研究.pdf

1、褪黑素(melatonin,MLT)是大腦下部松果體分泌的重要激素,由色氨酸合成,屬于吲哚類物質。在體內可以與特定受體結合產生一定的生物學效應,主要有:免疫調節(jié)作用,可以增強免疫力、抗腫瘤和降血壓；清除自由基及抗氧化作用,可以對細胞核DNA起到保護作用,還可以保護大腦免受自由基氧化損害。褪黑素的體內分泌受年齡的影響,隨年齡的增大分泌減少,成年人適當補充外源性褪黑素可以延緩衰老,還可預防高血壓,心臟病,動脈硬化等多種老年性疾病；神經系統(tǒng)方

2、面可以起到鎮(zhèn)靜調節(jié)中樞神經的作用,常用于消除時差反應,改善睡眠障礙等疾病；在生殖系統(tǒng)方面,有抑制性腺和副性腺發(fā)育,用于皮毛動物飼養(yǎng)上可以促進其皮毛發(fā)育和成熟,提高經濟效益。褪黑素為內源性物質,毒副作用小,用途廣泛,有廣闊的開發(fā)應用前景。
　　 目前,褪黑素用于人體的劑型有片劑和口服液等；用于動物增加皮毛生長的劑型有緩釋片或硅膠管埋植棒,現已上市的硅膠管埋植棒可緩釋3個月。由于褪黑素口服首過效應大,生物利用度低,半衰期短,需頻繁或

3、大劑量給藥,限制了其在人和動物體中的應用。
　　 本課題采用生物相容性好、生物可降解的磷脂、膽固醇和乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolicacids,PLGA)等載體材料將褪黑素制備成脂質體及微球等長效緩釋制劑,并且將脂質體、微球與以具備熱反相膠凝特性的泊洛沙姆407(商品名PluronicF127,PF127)為載體材料制備原位凝膠,用于皮下注射植入。既可以達到長效緩釋的效果,又有效的避免了生物不可

4、降解材料植入劑生物相容性差,植入過程復雜以及給病人帶來痛苦等缺點。為進一步開發(fā)褪黑素廣泛的生理學用途提供了可能。本文主要研究內容包括:
　　 1褪黑素脂質體的研究建立了MLT的含量測定方法；采用薄膜分散法制備MLT脂質體；以包封率為主要評價指標,在單因素考察的基礎上,采用均勻設計優(yōu)化處方和工藝；通過電子透射顯微鏡觀察脂質體外觀形態(tài)；激光散射粒度儀測定粒徑和Zeta電勢；以褪黑素溶液為對照,采用動態(tài)膜透析法測定MLT脂質體體外釋放

5、百分率并對其釋藥動力學進行研究；通過影響因素考察評價MLT脂質體初步穩(wěn)定性。結果表明,紫外分光光度法作為測定脂質體中MLT含量的方法,專屬性強、重現性及靈敏性好,操作簡便；在單因素考察基礎上,經均勻設計試驗得最優(yōu)處方為:藥脂比為1:25、磷脂與膽固醇的質量比為10:1,溫度40℃；透射顯微鏡下觀察脂質體外觀形態(tài)為圓整的球形小囊,平均粒徑為(5.542±0.04)μm,Zeta電勢為(-31.68±1.29)mV,包封率為(77.23±2

6、.51)％；與MLT溶液相比,MLT脂質體體外釋藥有明顯的緩釋作用(從10h延長至72h),體外釋藥更好地符合雙相動力學數學模型(100-Q=105.64e-0.3156t+44.19e-0.0492t,Rα=0.9886,Rβ=0.9874)。初步穩(wěn)定性試驗表明脂質體更宜低溫保存。
　　 2褪黑素PLGA微球的研究采用O/W型乳化-溶劑揮發(fā)法制備褪黑素PLGA微球,紫外分光光度法測定微球的包封率及載藥量。以包封率為評價指標,在

7、單因素考察的基礎上,采用正交設計試驗優(yōu)化處方和工藝；采用光學顯微鏡觀察微球的外觀形態(tài)；激光散射粒度分析儀測定微球的粒徑及粒度分布；動態(tài)膜透析法測定MLT-PLGA-MS體外釋放行為,以零級動力學方程,一級動力學方程、Higuchiequmion、Weibullequmion、Ritger-Peppasequation和Bioexponentialequation等數學模型對微球體外釋藥動力學特性進行擬合,分析體外釋藥機理；采用DSC法驗

8、證微球的形成；通過微球初步穩(wěn)定性考察,為將來制劑的包裝及貯存條件提供試驗依據。
　　 單因素考察結果表明影響微球包封率的主要因素為聚乙烯醇(polyvinylalcohol,PVA)濃度、PLGA濃度、二氯甲烷和丙酮體積比。經正交設計試驗篩選的最優(yōu)處方及制備工藝為:PVA濃度為3％,PLGA的濃度為40mg·mL-1,二氯甲烷和丙酮體積比為3:1,機械攪拌制備初乳的速度與時間為2,000r·min-1、90s,磁力攪拌除去有機溶

9、劑的速度與時間為400r·min-1、4h；加入2％的甘露醇作為凍干保護劑,采用低溫冷凍干燥法制備干燥MLT微球；DSC試驗結果驗證了微球的形成。采用優(yōu)化處方和工藝制備的三批褪黑素PLGA微球,外觀為白色粉末,光學顯微鏡下觀察其外觀形態(tài)為球形,無粘連；平均粒徑為(15.605±2.19)μm；平均包封率為(76.57±1.64)％；體外釋放可持續(xù)3個月,服從零級釋放模型(Q=0.0347t+3.5569,r=0.9549),呈現良好的緩

10、釋效果；加速試驗及長期試驗條件下考察,6個月內無明顯變化,穩(wěn)定性良好。
　　 3褪黑素脂質體、褪黑素微球原位凝膠劑的制備及體外釋藥性研究采用傾斜法測定凝膠的膠凝溫度,以能否獲得適宜膠凝溫度(20～36.5℃)及室溫條件下凝膠的通針性為依據篩選PF127原位凝膠處方,將制備的褪黑素脂質體和微球分散于原位凝膠中,以MLT凝膠劑為對照,采用動態(tài)膜透析法測定MLT脂質體凝膠劑和MLT微球凝膠劑體外釋藥特性,并分別進行數學模型擬合,分析其

11、釋藥機理。結果表明,制備脂質體及微球凝膠的PF127最優(yōu)濃度為18％；制備的脂質體原位凝膠和微球原位凝膠膠凝溫度分別為(23.3±0.3)℃和(22.8±0.4)℃,且在20℃以下通針性良好；體外釋放試驗結果表明,MLT脂質體凝膠劑與MLT凝膠劑相比有較好的緩釋效果(釋放時間從36h延長到120h),體外釋放服從一級動力學模型(ln(100-Q)=-0.0258t+4.2292,r=0.9695)；MLT微球凝膠與MLT凝膠劑相比有明顯

12、的緩釋效果(釋放時間從36h延長到2184h),體外釋放服從零級動力學模型(Q=0.037t+1.6731,r=0.9661)。由此可知,MLT微球凝膠劑較MLT脂質體凝膠劑緩釋效果更明顯。
　　 4MLT-MS-GEL藥代動力學研究采用高效液相色譜電化學檢測器測定大鼠血漿中褪黑素濃度,建立血藥濃度檢測方法并進行方法學考察。將釋放持續(xù)時間最久的原位凝膠制劑皮下注入大鼠皮下,以市售可緩釋3個月的動物用硅膠管植入棒為對照制劑,對制備

13、的長效緩釋原位凝膠制劑進行體內藥動學研究。
　　 方法學考察結果表明,所選色譜條件及藥物提取方法專屬性好,靈敏度高,內源性物質不干擾藥物的測定。血藥濃度在0.1～10μg·mL-1濃度范圍內線性關系良好(A=9829.4c-2155,r=0.9991),日內、日間精密度RSD分別為小于3％和5％,方法回收率大于98％,提取回收率大于75％,RSD均小于3％,滿足生物樣品測定要求。
　　 以市售動物用硅膠管植入棒為對照,研

14、究大鼠皮下注射褪黑素微球原位凝膠后體內的藥動學特性,血藥濃度-時間數據采用DASver2.0藥代動力學程序處理,按統(tǒng)計矩法求得到藥動學參數,結果表明,對照組和微球組血漿中AUC分別為5358.566μg·mL-1·h-1和5562.251μg·mL·h-1；平均滯留時間(MRT)分別為1014.304h和1090.405h；t1/2分別為68.593h和69.315h；表觀分布容積分別為0.330L·kg和0.181L·kg,對照組為微

15、球組的1.82倍。結果表明,制備的MLT微球原位凝膠在動物體內可以達到與市售硅膠管埋植棒相同的效果,更多的藥物進入體內大循環(huán)。由血藥濃度曲線可見,在體內釋放后期,微球原位凝膠維持比硅膠管埋植棒略高的血藥濃度,達到穩(wěn)定血藥濃度的效果。
　　 結論:本課題將褪黑素脂質體和微球制劑與原位凝膠結合起來,成功研制了具有長效緩釋效果的褪黑素新型可注射植入劑。脂質體、微球制劑的制備工藝簡便可行,具有良好的重現性和理想的包封率,體外釋放有明顯的

16、緩釋效果。將其以注射劑(靜脈注射或皮下注射)應用于人體,能延長藥物半衰期,提高生物利用度,擴大其臨床應用范圍。
　　 將褪黑素脂質體和微球分散于一定濃度的PF127原位凝膠中,制備常溫下可注射給藥的脂質體、微球原位凝膠。選擇其中體外釋放時間最長的微球凝膠制劑進行大鼠體內藥動學考察,與市售硅膠管埋植劑相比可發(fā)揮同樣的緩釋長效作用,與此同時還避免了硅膠管植入劑在應用上的不足,不需手術植入,只需通過注射器皮下注射即可在植入部位形成藥物