表達(dá)pri-mir-302-367基因的慢病毒顆粒的制備及其感染人臍血單個(gè)核細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)究.pdf

1、目的:制備可誘導(dǎo)表達(dá)pri-mir-302/367基因的重組慢病毒顆粒，并在HeLa細(xì)胞中研究該基因?qū)Χ嗄苄曰虻恼{(diào)控作用；通過病毒感染人臍血單個(gè)核細(xì)胞（human cord blood mononuclear cells，hCBMNC），旨在探究該基因?qū)CBMNC的重編程作用。
　　方法:（1）以正常人基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因，將目的基因連接入酶切線性化的pLV-TRE質(zhì)粒，構(gòu)建pLV-TRE-302慢病毒重組體

2、，酶切及測(cè)序予以鑒定。（2）通過重組質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞對(duì)慢病毒進(jìn)行包裝及滴度測(cè)定；用病毒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，強(qiáng)力霉素（doxycline,DOX）誘導(dǎo)后，通過real time-PCR測(cè)定miR-302/367家族基因及其下游調(diào)節(jié)基因Oct4、Sox2和Nanog的表達(dá)情況。（3）用病毒感染hCBMNC，經(jīng)DOX誘導(dǎo)后，在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下觀察其形態(tài)學(xué)變化，并用real time-PCR分別檢測(cè)多能性基因Oct4、N

3、anog、Sox2、Klf4和c-Myc的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:（1）成功制備pri-mir-302/367重組慢病毒顆粒，基因測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致，病毒滴度為5×106TU/mL。（2）DOX誘導(dǎo)72 h后，real time-PCR結(jié)果顯示HeLa細(xì)胞中miR-302/367家族基因及受其調(diào)節(jié)的多能性基因均得到不同程度的上調(diào)。（3）經(jīng)重組慢病毒感染的hCBMNC未見克隆形成，但real time-PCR結(jié)果顯示其多能性基