彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤微小殘留病變的實(shí)驗(yàn)與臨床研究及原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤臨床分析.pdf

1、第1章彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤微小殘留病變的實(shí)驗(yàn)與臨床研究 背景和目的：近20多年來，由于人們對非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma，NHL)生物學(xué)行為的深入認(rèn)識、有效藥物的不斷產(chǎn)生、新技術(shù)的應(yīng)用以及綜合治療的實(shí)施，使B細(xì)胞NHL的治療效果有了很大的提高，約80％的患者可以達(dá)到完全緩解(completeremission，CR)，但是一半以上的患者終究要復(fù)發(fā)。目前認(rèn)為復(fù)發(fā)來源于體內(nèi)殘留的耐藥淋巴瘤細(xì)胞，即微小殘留病變

2、(minimalresidualdisease，MRD)。如果這些導(dǎo)致復(fù)發(fā)的腫瘤細(xì)胞能被可靠地檢測出來，對指導(dǎo)淋巴瘤患者緩解后的治療、早期預(yù)測復(fù)發(fā)和預(yù)后、協(xié)助診斷分期將具有重要的意義，使我們的治療有可能達(dá)到分子水平的CR。 目前，診斷淋巴瘤微小殘留病灶，應(yīng)用較多和較成功的是，定性PCR的方法檢測骨髓、外周血干細(xì)胞和外周血單克隆IgH基因重排，協(xié)助分期、評價(jià)治療效果或微小殘留病變。該方法不能對起始模板數(shù)準(zhǔn)確定量。但臨床上發(fā)現(xiàn)陽性患

3、者并非都出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處浸潤。因此，推測IgH基因重排陽性患者是否復(fù)發(fā)，可能與IgH基因重排的表達(dá)量有關(guān)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timefluorescencequantitativepolymerasechainreaction，RT-FQ-PCR)具有敏感性高，特異性強(qiáng)，快速、微量、定量分析的優(yōu)點(diǎn)，非常適合用于檢測微小殘留病變。在B-NHL，染色體易位產(chǎn)生的融合基因和免疫球蛋白重鏈基因重排(immunoglobulinheav

4、y-chaingenerearrangment，IgH-R)均可作為RT-FQ-PCR檢測的靶分子。在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuselargeBcelllymphoma，DLBCL)因BCL-2/IgH易位只占20％～30％，而BCL-6基因與IgH發(fā)生易位時(shí)的斷裂點(diǎn)較分散，故使用IgH基因重排作為靶分子檢測較為合適。但是由于VDJ重排的多樣性使每一個(gè)B細(xì)胞克隆有它自己特異的DNA序列，即重排具有多樣性，突變的存在，而且突變可發(fā)生在

5、疾病發(fā)展的不同時(shí)期，使得通用的引物和探針的設(shè)計(jì)成為困難。熒光染料標(biāo)記的定量PCR方法不需要合成探針，使應(yīng)用RT-FQ-PCR檢測DLBCL的微小殘留病灶成為可能。 本研究采用簡單、快速、敏感性和特異性較高的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，采用熒光染料技術(shù)，結(jié)合半巢式PCR(semi-nestedPCR)方法，以IgH基因重排為標(biāo)志，對DLBCL患者治療前后骨髓微小殘留病變進(jìn)行定量分析，結(jié)合臨床特征，探討熒光染料標(biāo)記的實(shí)時(shí)定量PCR方法檢

6、測DLBCL微小殘留病變的可行性和臨床意義。 方法：44例DLBCL患者的57份骨髓標(biāo)本用于檢測IgH基因重排，10例非B細(xì)胞淋巴瘤的骨髓做對照組，Namalwa細(xì)胞系作陽性對照，U-937細(xì)胞系作陰性對照。淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，酚—氯仿—異戊醇抽提DNA，半巢式PCR和SYBRGreen熒光染料標(biāo)記的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分別檢測IgH基因重排CDRⅢ。2.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物片斷大小，β-actin作

7、內(nèi)參照，對IgH基因重排相對定量。 結(jié)果：1.分析融解曲線可以確定IgH基因重排產(chǎn)物的特異性。熒光定量PCR和半巢式PCR檢測IgH基因重排的陽性率分別為63.2％和71.9％。兩種方法均能在骨髓形態(tài)學(xué)陽性的標(biāo)本中檢測到IgH基因重排，敏感性達(dá)到100％。在初治患者和復(fù)發(fā)難治患者之間，IgH基因重排的陽性率兩種方法均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2.熒光定量PCR檢測IgH基因重排，以年齡、性別、分期、LDH值、IPI評分、腫塊大小和

8、B癥狀七個(gè)因素分組作比較，Ⅰ、Ⅱ期患者IgH基因重排表達(dá)量中位數(shù)為0，Ⅲ、Ⅳ期患者IgH基因重排表達(dá)量中位數(shù)為0.35，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，兩組患者之間有顯著性差異(p=0.018)，其余各組之間IgH基因重排陽性率統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差異。半巢式PCR的結(jié)果與之相似，Ⅰ、Ⅱ期患者IgH基因重排陽性率47.6％，Ⅲ、Ⅳ期患者IgH基因重排陽性率為82.6％，Ⅲ、Ⅳ期患者IgH基因重排陽性率高于Ⅰ、Ⅱ期患者(P=0.014)。 3.熒光定量P

9、CR檢測IgH基因重排，骨髓異型細(xì)胞數(shù)量與IgH基因重排表達(dá)量經(jīng)相關(guān)性回歸分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P=0.002)，對治療前后骨髓IgH基因重排的分析，4例骨髓形態(tài)學(xué)陽性者，隨著治療后細(xì)胞數(shù)量的減少和治療的好轉(zhuǎn)，IgH基因重排表達(dá)量也隨之下降，動態(tài)觀察表達(dá)量的變化可以評價(jià)療效。 4.半巢式PCR檢測IgH基因重排，7例患者治療前IgH基因重排陽性，治療后5例PR，2例SD，IgH基因重排仍然為陽性，提示病情未得到有效控制，可以

10、幫助判斷病情的發(fā)展趨勢，但不能精確地反映療效。 5.熒光定量PCR檢測IgH基因重排，LDH值高于正常組，IgH基因重排表達(dá)量為0.39，LDH值低于正常組，IgH基因重排表達(dá)量為0.01，經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)，兩組患者之間有顯著性差異(P=0.046)。 結(jié)論：1.熒光染料標(biāo)記的定量PCR方法結(jié)合半巢式PCR可用于彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的骨髓微小殘留病變的檢測，熒光染料標(biāo)記的定量PCR較半巢式PCR更好地反映骨髓微小殘留病變情況。

11、 2.檢測骨髓IgH基因重排，可以協(xié)助分期，Ⅰ、Ⅱ期患者檢測到IgH基因重排不能排除遠(yuǎn)處侵犯的可能。 3.動態(tài)觀察IgH基因重排表達(dá)量，可以反映疾病變化過程，評價(jià)療效。 4.未能確定檢測微小殘留病變在預(yù)測預(yù)后中的價(jià)值。 第2章原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤臨床分析 背景與目的：原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性淋巴瘤(primarycentralnervoussystemlymphoma，PCNSL)發(fā)病率上升并且

12、該病預(yù)后很差。本文目的是探討免疫正常的中國人的PCNSL的臨床特征，評價(jià)大劑量氨甲蝶呤(HD-MTX)治療PCNSL的療效。并探討半巢式PCR檢測免疫球蛋白重鏈基因重排在協(xié)助分型和分期診斷中的意義方法：回顧性分析經(jīng)病理證實(shí)的32例(中位年齡50歲)PCNSL患者的臨床資料和治療效果。2001年11月以前采用CHOP方案為主單用或聯(lián)合全腦放療的治療方法，2001年12月以后采用HD-MTX為主，單用或聯(lián)合全腦放療的治療方法。半巢式PCR檢

13、測患者石蠟組織和骨髓涂片IgH基因重排。 結(jié)果：本組PCNSL患者45歲以上的占78.1％，顱內(nèi)高壓為主要表現(xiàn)占75％，單發(fā)病灶占78.1％，未檢測到腦脊液細(xì)胞學(xué)陽性病例，B細(xì)胞淋巴瘤占87.5％，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤59.4％。32例中位隨訪期17.5個(gè)月(1～84個(gè)月)，Kaplan-Meier分析總中位生存期26個(gè)月，2年生存率52％；HD-MTX聯(lián)合放療組患者完全緩解率64.7％，中位生存期在28個(gè)月以上，2年生存率66

14、％，療效明顯優(yōu)于非HD-MTX聯(lián)合放療組；Logrank檢驗(yàn)顯示乳酸脫氫酶正常、活動狀態(tài)(PS)評分在0～1的患者生存期較長。Cox模型顯示PS狀況、LDH水平和治療措施是PCNSL的預(yù)后因素，PS越大、LDH水平越高，生存期越短，使用HDMTX+WBRT治療，患者生存期較長。 7例PCNSL中，5例檢測到IgH基因重排(71.4％)。10例骨髓涂片標(biāo)本，2例見IgH基因重排條帶。 結(jié)論：PCNSL多發(fā)于中老年人，顱內(nèi)高