復(fù)方茵黃解毒湯抗HBV有效部位的活性和成分研究.pdf

1、本課題以復(fù)方茵黃解毒湯(茵陳蒿湯+黃連解毒湯)作為研究對象，利用轉(zhuǎn)染乙肝病毒(HepatitisBVirus，HBV)的2.2.15細(xì)胞作為體外藥效學(xué)模型，對復(fù)方茵黃解毒湯主要提取部位的有效活性成分進(jìn)行體外抗乙肝病毒實(shí)驗(yàn)。以體外抗乙肝病毒藥效學(xué)結(jié)果為依據(jù)，對其進(jìn)行藥效學(xué)跟蹤研究，并對活性部位用各種現(xiàn)代分析儀器，研究其指紋圖譜。將中藥藥效組分的指紋圖譜定性和有效成分的定量研究相結(jié)合，建立復(fù)方茵黃解毒湯的在藥效學(xué)指導(dǎo)下的指紋圖譜和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2、 復(fù)方茵黃解毒湯的組方是以茵陳、溪黃草為君藥，蒲公英、梔子、黃柏、大黃、黃芩等為臣藥，共13味藥物組成。其功效為清熱利濕退黃、疏肝利膽和胃，主治肝膽濕熱證，臨床用于治療各種急、慢性肝炎、膽囊炎等病。本研究采用目前體外抗HBV藥物篩選和評價(jià)較好地細(xì)胞模型2.2.15細(xì)胞作為體外抗乙肝病毒的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討?fù)方茵黃解毒湯中對表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的抑制作用。先將復(fù)方茵黃解毒湯按極性由低到高分別用三氯甲烷、乙酸乙酯

3、和正丁醇分段萃取化學(xué)成分，得到各極性段的標(biāo)準(zhǔn)提取物，然后用2.2.15細(xì)胞進(jìn)行體外藥理活性篩選各萃取部位的抗HBV活性。通過分析，最終發(fā)現(xiàn)了乙酸乙酯提取部位活性較強(qiáng)，其在濃度為2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.3125mg/ml的HBsAg和HBeAg的抑制率分別為89.12％、85.81％、53.84％、44.31％和82.14％、62.43％、56.35％、44.20％。其抑制率分別高于陽性對照藥物干擾

4、素在10×103IU/ml、5.0×103IU/ml、2.5×103IU/ml、1.25×103IU/ml時(shí)的HBsAg和HBeAg的抑制率。干擾素的抑制率分別為50.63％、43.83％、34.79％、21.96％和57.09％、44.20％、32.97％、15.47％。這為開發(fā)抗乙肝藥物提供了理論依據(jù)。 采用薄層色譜法(TLC)對復(fù)方茵黃解毒湯中有效成分進(jìn)行鑒別，初步建立復(fù)方茵黃解毒湯薄層色譜鑒別方法，選擇λs=275nm，

5、λR=365nm雙波長掃描與λ=435nm單波長掃描，均為反射法鋸齒掃描，Sx=3，SwingWidth=10，狹縫0.4mm×0.4mm。對制劑的展開斑點(diǎn)進(jìn)行全程掃描，對鹽酸小檗堿、咖啡酸、阿魏酸、大黃酸的斑點(diǎn)及空白進(jìn)行部分或全程掃描。比較紫外雙波長掃描圖譜，得到供試品的掃描圖在與鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品峰的位置(約40mm～50mm)、咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品峰的位置(約125mm～135mm)、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品峰的位置(約145mm～155mm>有相對應(yīng)

6、的峰。另外，成品在大黃酸的位置(約155mm～165mm)的峰很明顯，但大黃標(biāo)準(zhǔn)品由于受前沿溶劑熒光帶峰(約165m～180mm)的影響較大，峰不明顯，但還仍可看到由大黃酸引起的肩峰。比較可見光單波長掃描圖譜，可見供試品的掃描圖在與鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品峰的位置(約40mm～50mm)、大黃酸標(biāo)準(zhǔn)品峰的位置(約160mm～170mm)相對應(yīng)，空白峰對于大黃酸的影響已消除。 采用HPLC法對乙酸乙酯提取部位的有效成分咖啡酸和阿魏酸進(jìn)行了

7、分析。精密量取復(fù)方茵黃解毒湯20mL置分液漏斗中，用三氯甲烷(20mL)萃取3次，棄去三氯甲烷液，再用乙酸乙酯(20mL)萃取3次，合并乙酸乙酯液，揮干乙酸乙酯，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜?0mL，用0.45um濾膜過濾至樣品小瓶中備用，作為供試品溶液。用HypersiLBDSC18作為分析柱，流動(dòng)相為甲醇-0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液(磷酸調(diào)pH為3.7)，得到的峰形較好，并且在18分鐘內(nèi)出峰完全。三個(gè)批號的含量分別是咖啡酸：99.7

8、6％、100.2％、99.35％和阿魏酸98.64％、101.2％、99.55％；加樣回收率的咖啡酸和阿魏酸平均值分別為99.29％、99.38％。結(jié)果表明，本方法簡單、可靠。可作為復(fù)方茵黃解毒湯中咖啡酸和阿魏酸的含量控制的一種有效方法。 在此基礎(chǔ)上采用毛細(xì)管電泳法(HPCE)對其進(jìn)一步分析。高效毛細(xì)管電泳法在現(xiàn)今的藥物分析中，比HPLC具有柱效高、分析速度快、進(jìn)樣體積小、易清洗等優(yōu)點(diǎn)；而且HPCE更適合于直接分析水溶液及未經(jīng)純

9、化的樣品，不需要消耗大量的高純有機(jī)試劑，節(jié)約了運(yùn)行費(fèi)用。在同樣電泳條件下，測定咖啡酸和阿魏酸對照品，并與復(fù)方茵黃解毒湯的HPCE圖譜相對比，在8分鐘和6分鐘的時(shí)間段上相對應(yīng)；同時(shí)，采用陽性對照法對樣品中咖啡酸和阿魏酸進(jìn)行定性，確認(rèn)了8分鐘的峰為咖啡酸和6分鐘的峰為阿魏酸。 采用高效快速、集靈敏度和高選擇性于一體的液相色譜.質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分離分析。通過液相色譜.質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)獲得了液相紫外圖譜和總離子流色譜圖，并采用MS和LC-M

10、S／MS掃描模式分析，鑒定了其中9個(gè)活性成分。分別是：咖啡酸m/z，179為M-H峰，160.9為M-H-OH峰，135為M-COOH-H峰；阿魏酸m/z，233為M+K峰，193為M-H峰，178.3為M-1-CH3峰；大黃酸m/z，283為M-H峰，257為M-CO峰，239.6為M-CO2峰，238.9為M-CO-OH峰；蘆薈苷m/z，417為M-H峰，256為M.glu峰，227為256-CO峰；乙酰紫草素M/Z329.0為M-