雙重?zé)晒鈱崟r定量RT-PCR同時檢測前列腺癌患者外周血DD3 mRNA和PSA mRNA的初步臨床應(yīng)用.pdf

1、目的： 采用Taqman-MGB探針技術(shù)，建立雙重?zé)晒鈱崟r定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(duplexFQ-RT-PCR)，對前列腺癌患者外周血DD3mRNA和PSAmRNA同時進行定量檢測，并進行初步臨床應(yīng)用評價。 方法： 1.根據(jù)Genebank的DD3mRNA和PSAmRNA序列，分別在DD3基因的外顯子1和3、PSA基因外顯子1和2之間設(shè)計一對引物，DD3基因和PSA基因的TaqMan-MGB探針分別標記FAM和

2、HEX熒光素，優(yōu)化反應(yīng)體系，建立雙重?zé)晒鈱崟r定量RT-PCR方法。 2.對本方法進行方法學(xué)評價，包括探針穩(wěn)定性、靈敏度、特異性和精密度等。 3.用雙重?zé)晒鈱崟r定量RT-PCR方法對49例前列腺癌(PCa)和71例前列腺增生(BPH)患者外周血DD3mRNA和PSAmRNA同時進行定量檢測，并對DD3mRNA和PSAmRNA診斷PCa的臨床應(yīng)用價值進行評價。 4.以發(fā)射式計算機斷層顯像(emissioncomput

3、edtomography，ECT)檢查結(jié)果作為PCa微轉(zhuǎn)移的金標準，對DD3mRNA和PSAmRNA診斷PCa微轉(zhuǎn)移的臨床應(yīng)用價值進行評價。 結(jié)果： 1.成功建立了雙重?zé)晒鈱崟r定量RT-PCR同時檢測DD3mRNA和PSAmRNA的方法，本方法的DD3mRNA和PSAmRNA最低檢測限分別為30拷貝/ml和200拷貝/ml，DD3mRNA批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為0.68％～1.25％和1.52％～3.51％，PSAmRN

4、A批內(nèi)和批問變異系數(shù)分別為0.99％～1.51％和2.01％～2.19％。擴增產(chǎn)物經(jīng)證實分別為DD3mRNA和PSAmRNA的特異性片段。 2.PCa患者外周血DD3mRNA和PSAmRNA含量明顯高于BPH患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。PCa組外周血DD3mRNA和PSAmRNA的陽性率隨臨床分期、Gleason評分增高而增加。而且隨臨床分期增加，外周血DD3mRNA和PSAmRNA含量均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜

5、0.01)；隨著Gleason評分增高，PSAmRNA含量也顯著增高(P＜0.01)；DD3mRNA含量隨著Gleason評分增高也有升高趨勢，但各組間外周血DD3mRNA含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 3.ROC曲線顯示當(dāng)DD3mRNA和PSAmRNA臨界值分別為846拷貝/ml和280拷貝/ml時，敏感性分別為69.4％和81.7％，特異性分別為90.1％和77.5％。若將DD3mRNA和PSAmRNA聯(lián)合用于PCa

6、的診斷，特異性為76.1％，其敏感性可增至85.8％。 4.以發(fā)射式計算機斷層顯像檢查(ECT)為微轉(zhuǎn)移的金標準，ROC曲線顯示當(dāng)DD3mRNA和PSAmRNA臨界值分別為為609拷貝/ml和908拷貝/ml時，敏感性均為90.9％，特異性分別為84.7％和30.8％；若將DD3mRNA和PSAmRNA聯(lián)合用于PCa微轉(zhuǎn)移的診斷，敏感性為90.9％，其特異性可增至92.3％。 結(jié)論： 1.成功建立了雙重?zé)晒鈱崟r定