前列腺癌患者組織和尿液端粒酶hTERT mRNA的定量檢測(cè)及其初步臨床應(yīng)用.pdf

1、目的：采用Taqman探針技術(shù),建立熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-RT-PCR)檢測(cè)端粒酶hTERT mENA的方法,對(duì)前列腺癌患者組織和尿液中端粒酶hTEIRTmRNA進(jìn)行定量檢測(cè)并對(duì)其臨床應(yīng)用進(jìn)行評(píng)價(jià). 方法：1.根據(jù)端粒酶hTERT mRNA全序列(NM198253),在端粒酶hTERT基因的外顯子2和3之間設(shè)計(jì)一對(duì)引物和一條Taqman探針,優(yōu)化反應(yīng)體系,建立端粒酶hTERT mRNA的FQ-RT-PCR方法.2.用

2、pMD18-T載體與普通PCR擴(kuò)增所得的端粒酶hTERT cDNA片段進(jìn)行連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品,將標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,以拷貝數(shù)的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),循環(huán)域值(Ct)為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.3.對(duì)本方法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià),包括探針穩(wěn)定性、靈敏度、特異度和精密度等等.4.用熒光定量RT-PCR對(duì)26例前列腺癌患者(PCa)組織和30例前列腺增生患者(BPH)組織,18例前列腺癌患者(PCa)的尿液和27例前列腺增生

3、患者(BPH)的尿液標(biāo)本,分別檢測(cè)端粒酶hTERT mRNA含量并進(jìn)行臨床應(yīng)用評(píng)價(jià).結(jié)果1.成功建立了實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)端粒酶hTERT mRNA的方法,本方法靈敏度高,可達(dá)10 copies/reaction,線形范圍廣,達(dá)10～1×10<'8>copies/reaction,重復(fù)性好,批內(nèi)CV:1.25﹪～2.06﹪,批間CV:3.32﹪～4.59﹪,Ct值與拷貝數(shù)之間具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.997.擴(kuò)增產(chǎn)物克隆

4、和測(cè)序分析顯示本擴(kuò)增片段為端粒酶hTERT特異性片段.2.30例良性前列腺增生(BPH)組織中端粒酶均未檢測(cè)到hTERT mRNA的表達(dá),而26例前列腺癌(PCa.)組織中有19例檢出(73.0﹪)hTERT mRNA表達(dá)陽性,PCa組含量(hTERT mRNA/GAPDHmRNA×10<'5>):9.64(0.00～20.81).hTERT mRNA在PCa組織中表達(dá)量顯著高于BPH組織(P<0.01).ROC曲線分析結(jié)果顯示ROC-

5、AUC=0.865(95﹪Cl:0.758～0.973),當(dāng)hTERT mRNA/GAPDH mRNA×10<'5>截?cái)嘀禐?.875時(shí),其敏感度達(dá)73.0﹪、特異度100﹪.從表達(dá)趨勢(shì)上看端粒酶hTERTmRNA在病理分化程度越差表達(dá)量越高,但尚不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),在不同臨床分期表達(dá)量也不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).3.在前列腺穿刺活檢前共收集18例前列腺癌(PCa)和27例前列腺增生(BPH)患者前列腺按摩后的尿液

6、.由于尿沉渣中不僅含有PCa細(xì)胞和非前列腺細(xì)胞,還含有其它脫落細(xì)胞如膀胱上皮細(xì)胞、腎小管細(xì)胞、尿道上皮細(xì)胞等,所以不能用管家基因校正前列腺細(xì)胞數(shù),PSA mRNA在正常前列腺細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)恒定,在PCa細(xì)胞中的表達(dá)有輕度下降(～1.5倍),所以用PSAmRNA校正尿沉渣中的前列腺細(xì)胞(PSAmRNA的檢測(cè)方法學(xué)已建立),尿液PSA mRNA表達(dá)呈陽性(Ct值<37個(gè)循環(huán))的標(biāo)本才被認(rèn)為含有足夠的前列腺細(xì)胞,方可用于端粒酶hTERT、mT

7、NA的檢測(cè).尿液端粒酶hTERT mRNA含量以端粒酶hTERT mRNA/PSA mRNA的比值乘以10<'4>來表示。 結(jié)果：PCa組(medianO,rarlge:0～0.728),BPH組(median,0;range:0～0)表達(dá)均為陰性,兩者相比具有顯著性差異(U=180.0,W=558.0,Z=-2.19,P<0.05).尿液端粒酶hTERT、mRNA的陽性率與臨床分期和病理分級(jí)無關(guān).分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ROC曲線下

8、面積(AUC-ROC)=0.630:(95﹪CI:0.456～0.803), 18例癌標(biāo)本中有6例檢出hTERT mRNA陽性,27例BPH組中2例檢出陽性,其檢測(cè)敏感度達(dá)33.3﹪,特異度92.6﹪,陽性預(yù)測(cè)值(PPV)75.0﹪,陰性預(yù)測(cè)值(NPV)67.5﹪,雖敏感度不高,但有很高的特異度.臨床最常用篩查PCa的指標(biāo)是血清PSA,雖有較高的敏感度,但特異度不高,在非惡性前列腺疾病時(shí)也會(huì)升高,而尿液hTERTmRNA敏感度低,但特異

9、度高,在PCa篩查時(shí)可以將兩者相結(jié)合,進(jìn)一步提高診斷效能. 結(jié)論：1.成功建立了熒光實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)端粒酶hTERT mRNA的方法,本方法具有敏感、特異、準(zhǔn)確、高效、重復(fù)性好、結(jié)果數(shù)據(jù)化等特點(diǎn).2.PCa組織中端粒酶hTERTmTNA特異性高表達(dá),為端粒酶hTERr.mRNA成為PCa診斷和監(jiān)測(cè)指標(biāo)提供了理論依據(jù).3.尿液端粒酶h17ERT mRNA用于PCa診斷較血清PSA存在敏感度不高,但有更高的特異性,在P