前列腺癌特異DD3 mRNA熒光定量方法的建立和初步應用研究.pdf

1、前列腺癌（PCa）是西方國家男性中最常見的腫瘤之一，占癌癥死亡率的第二位。隨著人類平均壽命的延長和診斷技術的提高，前列腺癌的發(fā)病率和檢出率在不斷上升。我國前列腺癌的發(fā)病率雖然低于西方發(fā)達國家，但其增長也呈明顯的上升趨勢。前列腺穿刺活檢是前列腺癌診斷的金標準，但是血清PSA>4ng/ml時穿刺陽性率只有1/3。近年來發(fā)現(xiàn)的人血管舒緩素激肽釋放酶2和前列腺干細胞抗原也被證實為前列腺癌特異性基因，但它們并不能提高前列腺癌的特異診斷方法。所以，

2、尋找新的前列腺癌診斷標志物，建立更加特異的診斷方法，是目前對前列腺癌診斷研究的熱點。
　　DD3基因是近年來所發(fā)現(xiàn)的一種前列腺癌特異基因。DD3mRNA既能高表達于癌性前列腺上皮細胞株中(>95％)，而且在前列腺癌發(fā)生時表達量明顯升高，其診斷敏感性和特異性大于90％，目前被認為是一個具有臨床應用潛力的前列腺癌標志物。進一步探明DD3基因在前列腺癌診斷、治療、預后評估等方面應用將具有重要意義。
　　本研究首先克隆了DD3基因片

3、段，即根據(jù)外顯子4設計一對引物，自LNCaP細胞中提取總RNA，以LNCaP細胞cDNA作模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產物經凝膠電泳純化后與PMD18-T載體連接，再將重組質粒轉化感受態(tài)細胞進行克隆；提取重組質粒在紫外分光光度計上定量，作為定量檢測的標準品。結果經重組質粒PCR擴增及序列測定，表明PMD18-T-DD3cDNA克隆成功，可作為前列腺癌熒光定量RT-PCR檢測方法的標準品并可應用于定量標準曲線的繪制，為前列腺癌DD3

4、特異性基因熒光定量PCR方法的建立提供保證。
　　本研究在完成DD3mRNA重組質粒標準品建立的基礎上，建立了實時熒光定量PCR檢測前列腺癌特異性DD3mRNA方法。經方法學驗證結果證實，其最低檢測限為1.64×101拷貝/ml，線性范圍為1.64×101～1.64×1011拷貝/ml，證明具有良好的敏感性；經對擴增產物純化后，直接測序分析并進行Blast同源性比較，證實有較好的特異性；同時經檢測具有良好的穩(wěn)定性和重復性。

5、　　我們針對27例前列腺癌組進行DD3mRNA檢測發(fā)現(xiàn)其陽性例數(shù)顯著高于非前列腺癌組和健康對照組，其中全血標本陽性例數(shù)為18(18)、尿液標本陽性例數(shù)為4(5)、前列腺液標本陽性例數(shù)為4(4)；而在30份非前列腺癌患者標本中只有1份前列腺液出現(xiàn)低拷貝值1.984log拷貝數(shù)/ml，其原因有待進一步觀察確定；30份健康人標本均為陰性。對前列腺癌進行病理分級后并觀測與DD3cDNA拷貝數(shù)的變化，結果DD3cDNA拷貝數(shù)隨病理分級的增加而增高

6、。
　　對全血DD3mRNA檢測與血清PSA的檢測進行檢測，結果在18例前列腺癌全血標本中發(fā)現(xiàn)DD3mRNA陽性例數(shù)為18，而PSA陽性例數(shù)為16；在20例非前列腺癌全血標本和10例健康全血對照標本中DD3mRNA均為陰性；PSA在非前列腺癌組出現(xiàn)4例陽性，經對4例PSA陽性患者的臨床病理結果調查，均不是前列腺癌。結果證明全血DD3mRNA檢測在特異性上優(yōu)于PSA。在測定PSAmRNA定量的基礎上，我們引入DD3得分概念，即將DD