尿液DD3mRNA和AMACRmRNA聯(lián)合診斷前列腺癌的價值評價及DD3基因生物學(xué)特性的初步研究.pdf

1、目的：1、評價前列腺按摩后尿液中DD3mRNA和AMACRmRNA的聯(lián)合定量檢測在前列腺癌診斷中的價值.2、對DD3基因的生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究,為進(jìn)一步研究其表達(dá)調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ). 方法：1、根據(jù)GenBank中的AMACRmRNA序列,在其外顯子2和3之問設(shè)計一對引物和一條Taqman-MGB探針,優(yōu)化反應(yīng)體系,建立AMACRmRNA的實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(FQ RT-PCR)檢測方法,并對其進(jìn)行方法學(xué)

2、評價.DD3mRNA的FQ RT-PCR檢測方法是本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的,該方法的檢測靈敏度達(dá)6拷貝/反應(yīng),線性范圍為6～6×10<'8>拷貝/反應(yīng),Ct值與拷貝數(shù)的對數(shù)之間具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)達(dá)0.994,方法具有良好的重復(fù)性,批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為1.25～2.06﹪和2.32～3.59﹪.2、本研究的臨床病例包括前列腺癌(PCa)組21例,年齡58～85歲,平均72歲,經(jīng)Jewett臨床分期:B期7例,C期4例,D期10例;

3、經(jīng)Gleason病理分級:高分化癌3例,中分化癌11例,低分化癌7例;良性前列腺增生(BPH)組27例,年齡51～83歲,平均69歲.3、前列腺穿刺活檢前,留取患者經(jīng)前列腺按摩后的尿液,離心取沉渣,用FQRT-PCR方法分別檢測其中DD3mRNA和AMACRmRNA的含量.由于尿沉渣中不僅含有PCa細(xì)胞和非惡性前列腺細(xì)胞,還含有膀胱上皮細(xì)胞、尿道上皮細(xì)胞等其它脫落細(xì)胞,故不能用管家基因GAPDH或β-actin來校正細(xì)胞數(shù).PSAmRN

4、A在正常前列腺細(xì)胞中表達(dá)相對恒定,在PCa細(xì)胞中的表達(dá)也僅有輕微下降(～1.5倍),而在其它脫落細(xì)胞中并不表達(dá),所以用PSAmRNA來校正尿沉渣中的前列腺細(xì)胞數(shù)(PSAmRNA的FQ RT-PCR檢測方法本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立),且只有PSAmRNA檢測呈陽性的尿液標(biāo)本才被認(rèn)為含有足夠的前列腺細(xì)胞,方可進(jìn)行DD3mRNA和AMACRmRNA的檢測.尿液DD3mRNA和AMACRmRNA的含量分別用比值DD3mRNA/PSAmRNA和AMACR

5、mRNA/DD3mRNA表示.本研究對前列腺按摩后尿液DD3mRNA和AMACRmRNA的聯(lián)合定量檢測在前列腺癌診斷的效能進(jìn)行了分析評價.4、檢測前列腺癌細(xì)胞株LNCap經(jīng)無雄激素培養(yǎng)基培養(yǎng)后以及經(jīng)含有不同濃度雙氫睪酮的培養(yǎng)基培養(yǎng)后DD3mRNA的表達(dá)變化情況. 結(jié)果：1、成功建立了檢測AMACRmRNA的FQ RT-PCR方法,該方法檢測靈敏度達(dá)5拷貝/反應(yīng),線性范圍為5～5×10<'8>拷貝/反應(yīng),Ct值與拷貝數(shù)之間具有良

6、好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.998.批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為1.68～2.30﹪和2.52～4.27﹪.PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和測序分析證實(shí)為AMACRmRNA的特異性序列.2、PCa組尿液DD3mRNA和AMACRmRNA的含量均明顯高于BPH組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).ROC曲線分析結(jié)果顯示,DD3mRNA和AMACRmRNA的曲線下面積(AUC-ROC)分別為0.767(95﹪CI:0.635～0.900)和0.7

7、27(95﹪CI:0.582～0.871),兩者的最佳截斷值(cutoff)分別為0.067和0.214,此時DD3mRNA和AMACRmRNA診斷前列腺的靈敏度分別為76.19﹪和66.67﹪,特異度分別為70.37﹪和74.07﹪,陽性預(yù)測值均為66.67﹪,陰性預(yù)測值分別為79.17﹪和74.07﹪.若將DD3mRNA和AMACRmRNA對前列腺癌進(jìn)行聯(lián)合診斷,其靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為90.48﹪、55.56

8、﹪、61.29﹪和88.24﹪,其中靈敏度和陰性預(yù)測值均明顯高于兩者單獨(dú)診斷時.如果血清PSA以4ng/ml為臨界值,則血清PSA診斷前列腺癌的特異度只有14.8﹪,故尿液DD3mRNA和AMACRmRNA無論是單獨(dú)診斷還是聯(lián)合診斷前列腺癌,特異度均明顯高于血清PSA.前列腺癌不同臨床分期和病理分級之間尿液DD3mRNA和AMACRmRNA聯(lián)合檢測陽性率無顯著性差異,但隨著病理分級的增高有上升趨勢.3、LNCap細(xì)胞經(jīng)無雄激素培養(yǎng)基培養(yǎng)

9、24h、48h及72h后,其DD3mRNA的表達(dá)量分別下降了63.14﹪、64.89﹪和81.57﹪,而在DHT濃度為0.05μg/L、0.5μg/L及5μg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后,DD3mRNA的表達(dá)量分別是無雄激素培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的1.94倍、5.07倍和7.11倍. 結(jié)論：1、尿液DD3mRNA和AMACRmRNA的聯(lián)合檢測具有較高的靈敏度和陰性預(yù)測值,在PCa的篩查和早期診斷中具有較好的臨床應(yīng)用價值. 2、D