產(chǎn)柚苷酶高產(chǎn)菌株的篩選、鑒定及產(chǎn)酶特性研究.pdf

1、利用脫苦酶實現(xiàn)蜜柚的脫苦，對營養(yǎng)成分無破壞，不影響或改變柚汁或蜜柚果酒的天然良好風(fēng)味，是最理想和最具產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景的方法，也是目前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本課題以自然界得到的菌株為出發(fā)菌株，對脫苦酶中最主要的一種酶一柚苷酶的高產(chǎn)菌株篩選、菌種鑒定，發(fā)酵產(chǎn)酶的周期規(guī)律，酶活力檢測方法的比較以及粗酶的基本性質(zhì)進(jìn)行了研究。 本文首先對由本實驗室從發(fā)霉的蜜柚果皮、腐爛柚果堆積處的土壤處分離篩選得到的共60株真菌菌株進(jìn)行了篩選。柚苷酶是一種誘導(dǎo)

2、酶，含柚皮苷粉或苦味物丙酮提取液的培養(yǎng)基是該菌株的最佳誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基。采用透明圈法和平板劃線法對菌株進(jìn)行了初步的純化分離，將所分離得到的純菌株接種于以0.5％柚皮苷粉為產(chǎn)酶誘導(dǎo)物的選擇性固體平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5d，通過觀察其生長情況對菌株進(jìn)行初篩；將初篩菌株接種到以0.5％柚皮苷粉為產(chǎn)酶誘導(dǎo)物的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、160rmp搖床培養(yǎng)5d，經(jīng)臺式中型低溫離心機(jī)離心(3500rpm，15min)后取粗酶液，用Dayis法測定酶

3、活，篩選出一株實驗室編號為P-61的菌株所產(chǎn)酶的酶活最高，為310.64，于是決定以該菌株做為后續(xù)研究的目標(biāo)菌株。通過對該菌株的有性觀察、外觀觀察和顯微鏡觀察得出結(jié)論：有性孢子不詳或不發(fā)生，鑒定編號為P-61菌種為有性世代還未被發(fā)現(xiàn)的半知菌類(FungiImperfeeti)。分生孢子穗球形，紫褐色至黑色，與叢梗孢科(Moniliaceae)，單孢亞科(AmerosporoideaeofMoniliaceae)，曲霉族(Aspergil

4、leael)，曲霉屬(AspergillusMich.exFr.)，黑曲霉組(A.niger)的描述基本上相吻合，因此，鑒定為此株菌為黑曲霉。 本實驗對黑曲霉P-61的發(fā)酵產(chǎn)酶規(guī)律進(jìn)行了研究，對比了利用紫外分光光度計測定柚苷酶酶活性的Dayis法和高效液相色譜法的優(yōu)劣之處，在相同的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)條件下，通過對柚苷酶的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中還原糖含量、柚皮苷含量、柚苷素含量和柚苷酶酶活隨培養(yǎng)時間增加而變化的趨勢觀察，得出結(jié)論：以柚皮苷溶液

5、濃度1.5g/L為為菌體生長誘導(dǎo)底物的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的產(chǎn)酶情況最為穩(wěn)定；用Dayis法測定酶活速度快，但可能受到柚皮苷降解的中間產(chǎn)物的干擾，準(zhǔn)確度較差，用高效液相色譜法測定酶活性，雖然前處理和開機(jī)操作比較煩瑣，但測定結(jié)果的準(zhǔn)確度較高，受到的干擾小。 最后，本實驗對28℃、160rpm搖床培養(yǎng)5d后的培養(yǎng)液，于4℃，用冷凍離心機(jī)經(jīng)5000×g離心15min得到的粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了基礎(chǔ)性的研究。確定采用二次沉淀法，先用30％的硫