血管內(nèi)皮細胞抗發(fā)形霞水母觸手提取物縮血管反應的作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　探討血管內(nèi)皮細胞( vascular endothelial cells, VECs)在抗發(fā)形霞水母(Cyanea capillata)觸手提取物(tentacle extract,TE)縮血管反應中的保護作用,為防治C.capillata蜇傷提供新思路和新靶點。
　　方法:
　　1、驗證TE對人奇靜脈內(nèi)皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)的毒

2、性作用:
　　1.1 MTT法測細胞存活率:收集我國沿海C. capillata并經(jīng)鑒定后提取C. capillata TE樣品。①以濃度梯度為控制因素,加入不同濃度(0μg/ml、0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml、320μg/ml)TE孵育細胞密度為4×105個/ml的HUVEC細胞6h,MTT法檢測經(jīng)HUV

3、EC細胞的存活率。②另一方面以不同濃度(1μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)TE不同時間(6h,12h,24h,48h)孵育細胞密度為4×105個/ml的HUVEC細胞,MTT法檢測HUVEC細胞的存活率。
　　1.2流式細胞術(shù)測TE作用后HUVEC細胞凋亡壞死:加入不同濃度(0μg/ml、1μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)TE處理HUVEC細胞6h后,采用流式細胞分析檢測HU

4、VEC細胞的凋亡。
　　2、血管舒縮因子前列環(huán)素(Prostacyclin,PGI2)、血栓素(Thromboxane, TXA2)、血管緊張素(AngiotensinⅡ,AngⅡ)含量檢測:
　　2.1加入不同濃度TE(0μg/ml,1μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml)作用HUVEC細胞6h,采用ELISA檢測不同濃度TE作用HUVEC細胞后分泌PGI2、TXA2、AngⅡ的含量。
　　2.2濃度為5μg/

5、ml TE加入HUVEC細胞后,分別作用0min、5min、30min、2h、6h、12h后,采用ELISA檢測TE不同孵育時間HUVEC細胞分泌PGI2、TXA2、AngⅡ的含量。
　　3、觀察SD大鼠股動脈血壓(Blood pressure,BP)變化:
　　SD大鼠(280~320g)麻醉后,行股主動脈插管及頸靜脈插管法,分別予①對照組(0.9％生理鹽水組);②1.4mg/ml TE組;③10μmol/L環(huán)氧合酶抑制劑

6、(吲哚美辛)+1.4mg/ml TE組;④10μmol/L血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(卡托普利)+1.4mg/ml TE組藥物干預。觀察1h內(nèi)股動脈BP的變化情況,以明確藥物干預效果及VECs在TE縮血管毒性過程中的保護作用,并為臨床治療水母蜇傷篩選出有效的治療藥物。
　　4、SD大鼠心臟、腎臟功能的影響:
　　在整體動物檢測BP變化情況實驗結(jié)束后,迅速從股動脈插管處抽取實驗動物動脈血,檢測心肌酶、腎功能(LDH、CK、sCr及

7、BUN)。
　　結(jié)果:
　　1、TE對HUVEC細胞存活率的影響:
　?、佼擳E濃度小于2.5μg/ml時,HUVEC細胞存活率為100%,細胞活性與正常對照組(TE濃度0μg/ml)相比無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05);當TE濃度大于5μg/ml時,HUVEC細胞開始出現(xiàn)死亡,TE濃度為5μg/ml時細胞存活率為97.55%,TE濃度為10μg/ml時細胞存活率為50%,當TE濃度為320μg/ml時HUVEC細胞已

8、幾乎全部死亡,細胞存活率僅為4.83%,以上結(jié)果均有統(tǒng)計學意義。因此在濃度為5~320μg/ml范圍內(nèi)時TE對HUVEC細胞的毒性作用具有濃度依賴性,隨著TE濃度的增加其對HUVEC細胞毒性增強。
　?、谕粷舛萒E隨著預孵時間的延長,對HUVEC細胞產(chǎn)生的毒性作用不斷增強,TE的毒性作用具有時間依賴性(P<0.05);當TE濃度為1μg/ml時,分別預孵HUVEC細胞6h和12h可見細胞存活率大于100%,由此可知TE在低濃度(

9、≤1μg/ml)短時間(≤12h)內(nèi)對HUVEC細胞具有促生長的作用,當TE濃度為2.5μg/ml時,預孵6h時細胞存活率100%,TE濃度為5μg/ml時,預孵6h時細胞開始出現(xiàn)死亡,TE濃度10μg/ml時HUVEC細胞大量死亡,細胞存活率小于50%(P<0.05)。
　　由以上實驗可知,濃度為5μg/ml的C.capillata TE預孵HUVEC細胞6h可引起細胞死亡,因此選擇濃度為5μg/ml的TE做后續(xù)的實驗;10μg

10、/mlTE預孵6h可引起細胞明顯死亡。
　　2、TE致HUVEC細胞凋亡與壞死:
　　TE濃度在1~10μg/ml濃度時,導致的細胞壞死不明顯(P>0.05),在1μg/ml和2.5μg/ml濃度時TE導致的細胞凋亡尚不明顯(P>0.05),當TE濃度5μg/ml時可有部分細胞凋亡,當TE濃度10μg/ml時可有大量細胞凋亡(P<0.05)。
　　3、血管舒縮因子PGI2、TXA2、AngⅡ含量檢測:
　?、貾G

11、I2隨TE作用濃度增加分泌量逐漸增大,TXA2隨TE作用濃度增加分泌量無明顯變化,PGI2/TXA2隨TE作用濃度增大比值增大,AngⅡ隨TE濃度增大分泌量增大,以上結(jié)果均有統(tǒng)計學意義。故HUVEC細胞分泌的PGI2、AngⅡ及PGI2/TXA2比值在TE作用下可發(fā)生變化,且具有劑量依賴性,隨TE濃度增大而增大。
　?、赥E(5μg/ml)預孵HUVEC細胞一定時間內(nèi)(0min~12h)可引起HUVEC細胞舒縮因子PGI2、TXA

12、2、AngⅡ分泌量改變,PGI2隨著TE刺激時間的延長分泌量逐漸增加,5min時分泌量達高峰,6h分泌量開始下降,但分泌量仍高于正常水平,12h與6h分泌量無明顯差別;TXA2隨著TE刺激時間的增加分泌量逐漸增高,在6h到達高峰,12h與6h分泌量無明顯差別; AngⅡ在5min分泌量仍高于正常水平,在2h達最高值,6h分泌量又下降,但分泌量仍高于正常水平,分泌量6h與12h分泌量無明顯差別,以上結(jié)果均具有統(tǒng)計學意義。
　　4、S

13、D大鼠股動脈BP變化
　　在觀察時間(60min)內(nèi),與對照組(0.9%生理鹽水組)相比,1.4mg/ml TE組SD大鼠股動脈BP在前10min內(nèi)明顯下降,10min時達最低值,后逐漸升高,60min時恢復至起始BP水平,整個觀察時間內(nèi)BP平均值均低于對照組;10μmol/L環(huán)氧合酶抑制劑(吲哚美辛)+1.4mg/ml TE組在觀察時間內(nèi)BP值較對照組無明顯變化;10μmol/L血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(卡托普利)+1.4mg/m

14、l TE組在前10min內(nèi)BP先下降后升高,在20~30min內(nèi)恢復至對照組水平,后BP繼續(xù)升高,且高于對照組,以上結(jié)果均具有統(tǒng)計學意義。
　　5、SD大鼠心、腎功能檢測:
　　在整體動物股動脈BP監(jiān)測實驗結(jié)束后,從股動脈抽取實驗動物動脈血,低溫超速離心后取上清,行血生化檢測結(jié)果顯示與對照組(0.9%生理鹽水組)相比,1.4mg/ml TE組SD大鼠心肌酶譜(LDH、CK)明顯升高,腎功能(sCr、BUN)嚴重損害;10μm

15、ol/L環(huán)氧合酶抑制劑(吲哚美辛)+1.4mg/ml TE組、10μmol/L血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(卡托普利)+1.4mg/ml TE組心肌酶(LDH、CK)升高較1.4mg/ml TE組低,腎功能(sCr、BUN)損害較較1.4mg/ml TE組輕,以上結(jié)果均具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:
　　1.證明了TE對HUVEC細胞有直接的毒性作用,一定濃度TE及預孵時間可導致HUVEC細胞壞死與凋亡,降低細胞存活率。