發(fā)形霞水母觸手提取物細(xì)胞毒性.pdf

1、隨著海洋資源的開發(fā)利用和水母數(shù)量的增多，水母?jìng)耸录絹碓蕉?，有毒水母蜇傷成為最常見的海洋生物傷。水母毒素是一類結(jié)構(gòu)新穎的肽類毒素，相對(duì)分子量從10～600 kDa不等，文獻(xiàn)報(bào)道的活性成分差異顯著。研究發(fā)現(xiàn)水母毒素具有細(xì)胞、心血管、神經(jīng)、肌肉、呼吸、循環(huán)、酶和皮膚壞死等多種生物活性，其中細(xì)胞毒性是水母毒素最具普遍意義的生物活性，在水母蜇傷中毒中起重要作用。目前水母毒素研究主要集中在毒素對(duì)整體動(dòng)物或離體臟器功能的影響等方面，更深入的細(xì)胞毒

2、性作用及其機(jī)制尚無明確報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。本文初步探討了TOE體內(nèi)外溶紅細(xì)胞毒性作用及其作用機(jī)制，提出稀釋的全血是一種比紅細(xì)胞懸液更加方便有效的溶血活性測(cè)定系統(tǒng)，并分析了TOE對(duì)4種離體細(xì)胞的毒性效應(yīng)，測(cè)定毒素作用后細(xì)胞中Ca2+、ATPase、MDA等各個(gè)指標(biāo)的變化，旨在從細(xì)胞水平研究TOE的毒性作用。
　　 方法為：首先，以紅細(xì)胞為代表檢測(cè)TOE的溶細(xì)胞活性(溶血活性)，體外比較SD大鼠稀釋的全血與紅細(xì)胞懸液的溶血活性差異

3、，觀察各種金屬陽(yáng)離子對(duì)溶血活性的影響；體內(nèi)追蹤TOE的溶血過程。觀測(cè)TOE對(duì)紅細(xì)胞滲透脆性的影響，電鏡觀察紅細(xì)胞膜的變化，SC5b-9測(cè)定試劑盒檢測(cè)其在毒素作用前后活性水平。將稀釋全血和紅細(xì)胞懸液兩套測(cè)試系統(tǒng)擴(kuò)展到包括人在內(nèi)的其它幾種動(dòng)物血樣進(jìn)行比較研究，觀察抗氧化劑對(duì)溶血活性的影響，驗(yàn)證全血測(cè)試系統(tǒng)的實(shí)用性，利用血漿和血清白蛋白干預(yù)探討溶血的可能機(jī)制。其次，原代培養(yǎng)SD大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)，與多種腫瘤細(xì)胞相比較，MTT法檢

4、測(cè)TOE對(duì)所培養(yǎng)細(xì)胞生存率的影響，測(cè)定LDH進(jìn)一步反映TOE的細(xì)胞毒性作用，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。利用熒光探針Fluo-3觀測(cè)TOE作用后細(xì)胞內(nèi)Ca2+的動(dòng)態(tài)變化，利用試劑盒分別測(cè)定正常細(xì)胞與TOE作用后細(xì)胞Ca2+、ATPase、MDA、NO等水平的變化。分別取TOE作用前后大鼠胸主動(dòng)脈血管，組織勻漿后測(cè)定Ca2+含量變化。
　　 結(jié)果表明，TOE的溶血活性在大鼠稀釋全血和紅細(xì)胞懸液兩個(gè)測(cè)試系統(tǒng)中都具有劑量依賴性，且紅細(xì)

5、胞懸液中的溶血活性高于稀釋全血。Mn2+，Zn2+，La3+，Cu2+和Fe2+能顯著抑制TOE的溶血活性。當(dāng)給予TOE(5 mg/kg i.v.)后，麻醉SD大鼠血清OD414在前10 min顯著快速上升，在接下來的3小時(shí)內(nèi)逐漸升高。最大和最小紅細(xì)胞滲透脆性在加入TOE(5 mg/kg i.v.)后隨著時(shí)間延長(zhǎng)明顯增加。透射電鏡觀察給予TOE(5mg/kg)30 min后的SD大鼠的動(dòng)脈血細(xì)胞樣本，發(fā)現(xiàn)在一些正常形態(tài)的紅細(xì)胞表面有大量

6、未知的復(fù)合物。體外SC5b-9復(fù)合物在與TOE共培養(yǎng)后呈顯著性上調(diào)，而靜脈給予TOE(5 mg/kg)180 min內(nèi)未見顯著性差異。利用稀釋全血和紅細(xì)胞懸液兩套溶血測(cè)試系統(tǒng)做比較研究發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞懸液中的溶血活性普遍高于稀釋的全血?？寡趸瘎〨SH和VC能抑制TOE的溶血活性，蛋白酶抑制劑對(duì)溶血活性影響不明顯。血清和單純的血漿成分—白蛋白對(duì)溶血活性有明顯劑量依賴性的抑制作用。MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，TOE對(duì)4種貼壁細(xì)胞均產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，且

7、原代培養(yǎng)的VSMCs比3種腫瘤細(xì)胞對(duì)毒素作用更為敏感。毒素作用后，VSMCs上清中LDH活性較正常細(xì)胞上清液明顯升高。鏡下觀察不同濃度TOE作用24 h后各組細(xì)胞的形態(tài)發(fā)現(xiàn)，隨TOE劑量的升高，細(xì)胞漂浮、腫脹、折光性差等變化更加明顯，大量細(xì)胞破裂、崩解、死亡。Fluo-3追蹤TOE作用后VSMCs胞內(nèi)Ca2+的動(dòng)態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，10 min內(nèi)胞內(nèi)Ca2+出現(xiàn)明顯的升高過程，隨之進(jìn)入平原期，1小時(shí)后又一次較大幅度的升高。TOE作用后勻漿細(xì)胞中

8、Ca2+水平升高，而Na+-K+-ATPase及Ca2+-ATPase活性沒有明顯變化，MDA及NO變化也不明顯。TOE作用后SD大鼠血管平滑肌組織勻漿也顯示了Ca2+升高的變化趨勢(shì)。
　　 本文首次同時(shí)使用稀釋全血和紅細(xì)胞懸液兩套測(cè)試系統(tǒng)進(jìn)行體外溶血活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TOE在紅細(xì)胞懸液中的溶血活性普遍高于稀釋的全血，表明血漿中白蛋白成分可能具有溶血保護(hù)作用。TOE在體內(nèi)的溶血過程分為兩個(gè)階段：第一階段為快速直接的溶血，隨后是漸進(jìn)的

9、溶血，體內(nèi)溶血與體外溶血的過程是不一致的。綜合多種陽(yáng)離子和抗氧化劑對(duì)溶血活性的影響、紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)、透射電鏡觀察、SC5b-9活性測(cè)定等實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)氧化損傷和孔道形成在TOE的溶血過程中起主要作用。采用原代培養(yǎng)VSMCs細(xì)胞檢測(cè)TOE對(duì)細(xì)胞的毒性作用，發(fā)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞相比，VSMCs細(xì)胞對(duì)TOE最為敏感，這進(jìn)一步證明水母毒素作用靶點(diǎn)主要是心血管。TOE作用后胞內(nèi)鈣水平出現(xiàn)升高-平衡-升高的動(dòng)態(tài)變化過程，說明胞內(nèi)Ca2+升高可能首先是