基于滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的低豐度蛋白質(zhì)檢測.pdf

1、目的:
　　蛋白質(zhì)是人體中重要的大分子化合物，高靈敏的蛋白質(zhì)檢測在疾病的臨床診斷和治療具有重要意義。因?yàn)樵S多少數(shù)重要的蛋白質(zhì)足以影響到細(xì)胞生物學(xué)功能并觸發(fā)病理生理過程。然而，由于許多蛋白質(zhì)分子在體內(nèi)的濃度很低，因此，低豐度蛋白的檢測過程中的信號放大是一個關(guān)鍵問題。本文結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplificationRCA)技術(shù)建立一種低豐度蛋白質(zhì)的高通量檢測方法，并將其用于血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascula

2、r endothelial growth factor，VEGF）的檢測。
　　方法:
　　結(jié)合了靈敏度高和特異性強(qiáng)的滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circleamplification，RCA)技術(shù)和抗原-抗體免疫反應(yīng)，設(shè)計出了一種聯(lián)級信號擴(kuò)增方法，以實(shí)現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì)的超靈敏檢測。利用VEGF免疫試劑盒，以鏈酶親和素為橋梁，生物素修飾的單鏈寡核苷酸引物可以高親和力地連接到生物素標(biāo)記的免疫復(fù)合物上，建立低豐度蛋白質(zhì)的檢測平臺，通

3、過RCA擴(kuò)增形成大量的重復(fù)序列可以作為優(yōu)良的模板，單鏈DNA分子上串聯(lián)重復(fù)序列的每個單元均可與一個生物標(biāo)記的雜交探針互補(bǔ)雜交，從而有利于鏈親和素-辣根過氧化物的有序組裝，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)信號的放大。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)過不斷優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，對VEGF檢測的靈敏度達(dá)到10fM。與常規(guī)的酶標(biāo)二抗體系ELISA法相比，本方法具有更高的靈敏度，適于低豐度蛋白質(zhì)的檢測。
　　結(jié)論:
　　本研究所建立的滾環(huán)擴(kuò)增策略具有很強(qiáng)的信號放大能