蛋白質(zhì)生化技術(shù)

1、蛋白質(zhì)生化技術(shù),南開大學生命科學學院Protein Biochemistry Lab Nankai University 葉麗虹,SELDI蛋白指紋技術(shù)GST Pull-Down報告基因系統(tǒng)PTDs,蛋白質(zhì)芯片-飛行質(zhì)譜系統(tǒng)及其在分子生物學中的應用,背景介紹,蛋白指紋質(zhì)譜技術(shù)（SELDI，Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization，表面增強激光解吸技術(shù)）是

2、2002年諾貝爾化學獎的核心技術(shù)，具有快速、簡單和靈敏等優(yōu)點,它不僅可在腫瘤診斷中用于發(fā)現(xiàn)標志物、觀察治療效果,還可用于研究蛋白質(zhì)的修飾、相互作用、信號傳導和酶促調(diào)節(jié)等,從而實現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平的大規(guī)模功能研究。,傳統(tǒng)蛋白組學研究（2D-MS）的局限性,由于外加電場下的PH梯度不穩(wěn)定，重復性差 加樣量小，分離的蛋白質(zhì)很難鑒定可分析的蛋白質(zhì)最多約1500種，難以檢出蛋白質(zhì)中占很大比例的低豐度蛋白質(zhì)對于分離跨膜蛋白仍是技術(shù)難點電泳膠上的

3、蛋白質(zhì)斑點很大部分包含一種以上蛋白，以依次鑒定單個蛋白斑點為基礎(chǔ)，限制了檢測通量消耗時間長，一次電泳要5小時以上 對技術(shù)水平要求高，不能完全自動化染色轉(zhuǎn)移等環(huán)節(jié)操作技術(shù)條件要求高，耗時，不適應于大規(guī)模篩查和臨床檢測,SELDI技術(shù)的優(yōu)勢,直接用粗生物樣品（血清、尿、體液）進行分析 同時快速發(fā)現(xiàn)多個生物標記物微量樣品 (as few as 2000 cells for LCM samples)高通量的驗證能力（ with 1

4、000s of samples a month）發(fā)現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì) 測定疏水蛋白質(zhì): 與“雙相電泳加飛行質(zhì)譜”相比，除了有相似功能外，并可增加測定疏水蛋白質(zhì)在同一系統(tǒng)中集發(fā)現(xiàn)和檢測為一體,特異性高 ：利用單克隆抗體芯片，可鑒定未知抗原/蛋白質(zhì)，以減少測定蛋白質(zhì)序列的工作量可以定量：利用單克隆抗體芯片，由于結(jié)合至芯片上的抗體是定量的，故可以測定抗原量，但一般飛行質(zhì)譜不用于定量分析功能廣 ： I.利用單克隆抗體芯片, 可替代

5、 Western Blot II. 利用單克隆抗體芯片, 可互補流式細胞儀不足的功能，如將細胞溶解，可測定細胞內(nèi)的抗原, 而且靈敏度遠高于流式細胞儀,系統(tǒng)介紹,SELDI技術(shù)的蛋白質(zhì)芯片－飛行時間質(zhì)譜儀器由三部分組成：蛋白質(zhì)芯片閱讀器（Protein Chip Reader）飛行時間質(zhì)譜檢測系列（PBSIIC系列）分析軟件（Protein Chip軟件）。,操作流程示意圖,生物初樣品（血清/細胞裂解液）：蛋白質(zhì)通過親

6、合作用結(jié)合到芯片的化學或生物位點上；清洗蛋白質(zhì)芯片：用水洗去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和緩沖液中的雜質(zhì)，以消除干擾；加能量吸收分子 EAM（Energy Absorb Molecule） or “Matrix”：芯片 經(jīng)室溫干燥后，加能量吸收分子 EAM到每個 點上，使其與蛋白質(zhì)結(jié)成混合晶體，以促進蛋白質(zhì)在飛行時間質(zhì)譜檢測中的解吸附和離子化,,,,SELDI蛋白質(zhì)芯片的制備,1,2,3,,,飛行時間質(zhì)譜檢測,激光解吸電離的方法將保留在芯

7、片上的蛋白質(zhì)解離出來電離的蛋白質(zhì)可以通過飛行時間質(zhì)譜被精確地測定出它們的質(zhì)量,Protein Chip Reader工作草圖,,Protein Chip 軟件,化學表面芯片,分為疏水、親水、陽離子、陰離子和金屬離子螯合芯片五種，用于檢測未知蛋白，獲取指紋圖譜?；瘜W表面芯片可以直接用粗生物樣品（血清、尿樣、體液）進行分析，能同時快速發(fā)現(xiàn)多個生物標記物，測定疏水蛋白質(zhì)特別是膜蛋白。,芯片的種類,生物表面芯片,生物表面芯片分為抗體－抗原、

8、受體－配體和DNA－蛋白質(zhì)芯片等種類，可顯示與之相結(jié)合的抗原或者配體的不同分子量亞型，這種芯片的特異性高，可以定量。,蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)提供了一個單一、快速和特異的平臺，成為蛋白質(zhì)組學研究的多個領(lǐng)域的強大平臺。 能夠用于下列研究：生物標志物發(fā)現(xiàn)、表達差異繪圖、作用差異繪圖、抗體抗原作用、DNA與蛋白的相互作用、蛋白鑒定和多肽作圖、蛋白質(zhì)純化、表位作圖、糖基化分析、磷酸化/信號傳導途徑分析、蛋白與蛋白之間作用、受體配體作用、毒性標

9、志物發(fā)現(xiàn)、臨床數(shù)據(jù)分析等。,在發(fā)現(xiàn)生物標志物上的優(yōu)勢,抓住了疾病的本質(zhì)，絕大多數(shù)疾病都有特異的生物標志物（Bio-marker），在SELDI技術(shù)中質(zhì)譜的峰值是對這些生物標志物最直接的反映。有一套靈敏的檢測系統(tǒng)來檢測和識別這些微量的生物標志物 。,發(fā)現(xiàn)生物標志物,能夠?qū)υS多不同的樣品進行比較分析，軟件功能強大，分析獲得的譜圖可以多種形式表示，并應用疊加合成等手段篩選出特別的差異峰，從而確定生物標志物，該方法迅速便捷。,蛋白質(zhì)純化,提

10、供了便捷的蛋白質(zhì)純化方法，能夠優(yōu)化最佳色譜條件（如PH值、洗脫條件），對目的蛋白質(zhì)進行有效的分離。,蛋白質(zhì)鑒定,從蛋白質(zhì)芯片對結(jié)合的蛋白質(zhì)進行消化，或者事先對蛋白質(zhì)混合物進行蛋白酶切處理，再結(jié)合到蛋白質(zhì)芯片。結(jié)合質(zhì)譜分析，能夠得到消化片段的分子量，從數(shù)據(jù)庫中進行檢索就能夠獲得相應蛋白質(zhì)的序列信息。,分子間作用,預先對芯片的點進行處理，偶聯(lián)抗體或者其他蛋白（或者其他的誘餌分子），制備定制芯片。將待檢測包含可能結(jié)合分子的溶液與芯片進行雜交，

11、洗脫后對結(jié)合上的綁定蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜分析，獲得結(jié)合蛋白質(zhì)的相關(guān)信息。,轉(zhuǎn)錄后修飾,能夠確定樣品中特定分子量的蛋白質(zhì)，而這些蛋白質(zhì)的各種修飾對分子量的改變導致了獲得相應峰的位移，從而精確表述蛋白質(zhì)的修飾狀況。,臨床應用,蛋白質(zhì)指紋質(zhì)譜技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應用于多種疾病，如癌癥、老年病、傳染性疾病、心血管病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床診斷，其中應用于癌癥的最多，被認為是分子醫(yī)學的一場革新，極大的提高了各種疾病的診斷率。,疾病的診斷、療效監(jiān)測和預后判斷,腫

12、瘤：前列腺癌 乳腺癌 卵巢癌 膀胱癌 白血病 肺癌 腦癌 大腸癌其它疾?。杭毙阅I功能衰竭 急性心力衰竭, 動脈硬化癥 暴露在空氣中的毒素神經(jīng)精神病學 ：早老性癡呆 憂郁癥 精神分裂癥 巴金森氏 Huntington’s 傳染?。篐IV 鼠疫桿菌Yersinia pestis 分支桿菌Mycobacterium 柄細菌Caulobacter 鏈球菌Streptococcus 肉毒中毒Botulism 盶病毒Prions 黑死病病毒

13、Yersinia,臨床診斷腫瘤,肝癌 甲胎蛋白AFP 91% 89% 肺癌 NSE 82% 95% 胃癌 癌胚抗原CEA 91%

14、 94% 前列腺癌 PSA 83% 97% 乳腺癌 癌抗原CA153 93% 91% 卵巢癌 癌抗原CA125 99%

15、 99% 腸癌 癌胚抗原CEA 83% 92% 胰腺癌 CA199 82% 85% 膀胱癌 尿液檢測 93%

16、 87% 鼻咽癌 92% 97% 食道癌 84% 91% 喉癌

17、 97% 97%,腫瘤 傳統(tǒng)標志物 靈敏度 特異性,,SELDI腫瘤蛋白指紋,,,發(fā)病機理研究,著名的艾滋病學家何大一教授借助SELDI技術(shù)，在3個月內(nèi)所定了α-defensin 1，2，3 三種蛋白對艾滋病有抑制作用，這是正常人體內(nèi)沒有的蛋白質(zhì)，這一發(fā)現(xiàn)使研制艾滋病蛋白抑制劑一直成為可能。乙肝病毒感

18、染-肝硬化-肝癌是導致乙肝患者最終死亡的發(fā)病三步曲，通過SELDI，檢測乙肝病毒攜帶者、肝硬化及肝癌病人的血清蛋白，發(fā)現(xiàn)三種疾病的質(zhì)譜峰，檢測其它樣品時靈敏度為80%，特異性為81.8%，這種手段無創(chuàng)傷，并且可以不間斷的跟蹤檢測，為正確治療提供科學可靠的技術(shù)依據(jù)。,其他應用,新藥開發(fā)與藥理學研究，藥物毒性實驗等，利用SELDI技術(shù)可以準確的側(cè)到藥物中的特異基因，活性基因與滅活基因。對臨床用藥具有很好的有指導作用 ?；A(chǔ)理論研究：蛋白

19、質(zhì)的純化，蛋白質(zhì)的鑒定，蛋白質(zhì)功能的研究，已知樣品中某種功能蛋白，可通過該技術(shù)尋找功能蛋白。蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用研究，如有已知抗體、受體酶，可用該技術(shù)獲得其靶蛋白（抗原、配體和底物），形成DNA或者RNA結(jié)合蛋白的研究，確定抗原決定簇，蛋白質(zhì)磷酸化，糖基化研究，用于尋找與疾病有關(guān)的磷酸化，蛋白及新型生物標志物的開發(fā)與應用等。,GST Pull-Down（谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶沉淀試驗）方法尋找結(jié)合蛋白,Protein Biochemis

20、try Lab Nankai University,背景,蛋白質(zhì)間相互作用的研究作為了解蛋白質(zhì)生物功能的重要手段之一，在功能基因組學研究中極為重要。蛋白質(zhì)間相互作用存在于機體每個細胞的生命活動過程中。生物學中的許多現(xiàn)象如細胞凋亡、細胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導和癌變等均受蛋白質(zhì)間相互作用的調(diào)控。,Protein Biochemistry Lab Nankai University,簡介,GST Pull-down技術(shù)是近年來發(fā)展的一種敏感性及

21、特異性均較高的體外鑒定兩蛋白之間相互作用的重要方法1991年由Kaelin的研究組最早應用GST Pull-down技術(shù)在混合蛋白溶液尋找到結(jié)合蛋白利用谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）融合蛋白對谷胱甘肽偶聯(lián)球珠的親和性，從可能含有相互作用蛋白的溶液中純化相互作用的蛋白,Protein Biochemistry Lab Nankai University,實驗步驟,原核表達并純化GST融合

22、的已知蛋白。同時，應用放射性同位素（ 35S）對細胞裂解物進行標記。將GST融合蛋白與標記好的細胞裂解物混合，同時加入谷胱甘肽偶聯(lián)球珠，溫浴使得融合蛋白的GST能夠與球珠結(jié)合。通過離心方法收集GST融合蛋白以及與其結(jié)合的可能的蛋白分子 。在收集到的混合物中加入谷胱甘肽或者直接煮沸，使得目的的混合物能夠從球珠上洗脫下來，溶解在SDS-PAGE 上樣緩沖液中。將獲得的混合物進行SDS-PAGE電泳，進行放射自顯影或者蛋白染色，進而

23、轉(zhuǎn)膜進行Western blotting 實驗鑒定。還可應用質(zhì)譜的方法對找到的結(jié)合蛋白進行分析，確定未知蛋白的氨基酸組成，從而找到與已知蛋白結(jié)合的因子。,Protein Biochemistry Lab Nankai University,應用,確定融合蛋白與未知蛋白間新的相互作用證實融合蛋白與已知蛋白質(zhì)間可能的相互作用,Protein Biochemistry Lab Nankai University,GST Pull-Dow

24、n檢測蛋白的作用,原核表達的已知蛋白細胞裂解液中的未知蛋白質(zhì)應用cDNA文庫，進行體外翻譯的蛋白質(zhì)文庫中的未知蛋白半定量檢測蛋白與蛋白的親和作用,Protein Biochemistry Lab Nankai University,GST,Protein X,GST,,,,,,,35S-labled cell lysate,(glutathione-sepharose beads),(glutathione-sepharose b

25、eads),35S-labled cell lysate,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,GST,Protein X,GST,GST,,,,,,,Interact at 40C,,,Microfuge to collect complexes,Protein Biochemistry Lab Nankai University,實驗步驟,,,,,,,,,,,,1 2 3,autoradiograph,

26、Analyze by SDS-PAGE,Lane1. MarkerLane2. GST-proteinXLane3. GST,,,,GST,,,,GST,Protein X,,,,Protein Biochemistry Lab Nankai University,實驗步驟,,,,,,,Protein Biochemistry Lab Nankai University,Protein Biochemistry Lab Nankai

27、 University,GST pull down驗證兩種已知蛋白質(zhì)的相互作用,舉 例,,input,GST,Y-GFP + + +,X-GST,,Y-GFP,X-GFP + + +,GST,input,,105kD,Anti-GFP,Anti-GFP,Y-GST,X-GFP,Protein Biochemistry Lab Nankai University

28、,報告基因系統(tǒng),,gene；luciferase；green fluorescent protein 報告基因(report gene)是指一組編碼易被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，將其與目的基因融合表達后，可通過報告基因產(chǎn)物的表達來“報告”目的基因的表達調(diào)控。這項技術(shù)靈敏度高、檢測簡便可靠、適于大規(guī)模生產(chǎn)，因而在監(jiān)測細胞信號轉(zhuǎn)導，基因表達和藥物篩選等方面得到廣泛應用。一般的報告基因需要滿足以下幾個條件：(1)基因被克隆并且已知全序列；(2)

29、宿主不存在報告基因產(chǎn)物或者不存在類似的內(nèi)源性物質(zhì)；(3)表達產(chǎn)物易被檢測；(4)報告分子的分析結(jié)果應具有很寬的線形圍，以便分析啟動子活性的幅度變化?；(5)報告基因在細胞或動物內(nèi)表達對其正常的生理作用或活性沒有影響?，F(xiàn)主要以目前應用最廣泛的報告基因熒光素酶和綠色熒光蛋白為例，綜述報告基因的新近應用研究進展。1 熒光素酶(1uciferase，luc) luc是能催化熒光素或者脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱。根據(jù)來源不同主要分為細菌熒光素酶

30、(bacterial luciferase，BL)、螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase，F(xiàn)L)以及以海星、發(fā)光魚、發(fā)光甲蟲等為來源的熒光素酶，目前研究最廣泛并且成為商品酶的是BL和FL。,報告基因的研究背景,要研究基因的功能，基因的調(diào)控機制非常重要，基因的表達產(chǎn)物很復雜并難以準確的定量和定性。研究報告基因系統(tǒng)成為一種簡單的研究基因調(diào)控的方法。對真核基因調(diào)控的了解，主要來自野生型和突變型的假定順式作用調(diào)控元件的活性測定

31、實驗，是在轉(zhuǎn)染的真核細胞中進行的。在大多數(shù)情況下不直接測定調(diào)控元件的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄速率的能力,而是把順式調(diào)控元件與一種編碼新的產(chǎn)物的,被稱為報告基因的基因序列連接起來,在基因的轉(zhuǎn)錄過程中,測定報告基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量,來判斷順式調(diào)控元件的調(diào)控能力。,一般的報告基因需要滿足以下幾個條件：基因被克隆并且已知全序列；宿主不存在報告基因產(chǎn)物或者不存在類似的內(nèi)源性物質(zhì)；報告基因編碼的產(chǎn)物的檢測應該快速、簡便、靈敏度高而且重現(xiàn)性好；細胞內(nèi)其它的基因

32、產(chǎn)物不會干擾報告基因產(chǎn)物的檢測。報告基因的表達同樣也不能影響或改變細胞正常的生理活性。報告分子的分析結(jié)果應具有很寬的線形圍，以便分析啟動子活性的幅度變化；報告基因在細胞或動物內(nèi)表達對其正常的生理作用或活性沒有影響。,報告基因通常是在報告基因載體質(zhì)粒中與被檢測基因序列相連, 提取大腸桿菌中擴增的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染入目的真核細胞中。與此同時還要將一有真核啟動子和增強子的另一種報告基因質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)染同一細胞,以作為轉(zhuǎn)染率的內(nèi)對照。

33、目前已有很多的方法用于報告基因的測定如: 比色法、熒光法、生物發(fā)光法、化學發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法及原位染色法及流式細胞儀法。,報告基因的種類 氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶報告基因(chlormnphenicol acetyl transferase,CAT) 細菌的CAT酶能將乙?；鶑囊阴］o酶Ａ轉(zhuǎn)移到氯霉素上,而使其失去抗菌性。該反應能通過測量放射性標記的底物而量化。放射性同位素標記底物有3Ｈ標記的乙酰輔酶Ａ

34、和14Ｃ標記的氯霉素或用熒光素標記其中之一。CAT抗體可用于ELISA法檢測CAT。 優(yōu)點：在真核細胞中的本底很低；結(jié)果的重現(xiàn)性很好；靈敏度很高。 缺點：只能用細胞提取物進行測定；測定的范圍很窄；可能有放射性同位素的污染。,β 半乳糖苷酶報告基因(βgalatosidase,β gal) 大腸桿菌編碼的βgal能水解乳糖為半乳糖。雖然在很多細菌、植物和動物細胞中存在較高的本底,而

35、限制了它的使用,但常用做轉(zhuǎn)染的參照體系。通過使用特定的方法,還能夠區(qū)別內(nèi)外源性的β gal(改變緩沖液的ｐＨ等) 檢測方法:比色法、熒光法、化學發(fā)光法、FACS等。,β 葡萄糖苷酸酶(β glucuronidase,β GUS)報告基因 是大腸桿菌的又一水解酶,它能水解葡萄糖苷酸。 主要用于缺乏該酶的病毒性植物病原體、植物、酵母、及真菌等的研究中,在醫(yī)學研究中相對應用較少。 相關(guān)產(chǎn)品

36、 ICN公司的Aurora GUS試劑盒 ，應用了MUG(4 methylumbelliferyl β D glucuronide)使實驗的靈敏度比同類的熒光分析更加靈敏，且能使存在動植物細胞中的熒光本底降低很多,分泌型堿性磷酸酶(Secreted alkaline phosphatase, SEAP)報告基因 該酶為人胎盤堿性磷酸酶(PLAP)的突變體,也有從北大西洋海域中的耐熱細菌中分離出耐熱型AP。

37、 由于該酶能分泌到細胞外,在檢測時,可以在不破壞細胞的情況下,任意時間都可以取細胞培養(yǎng)上清液進行重復的、動態(tài)的檢測, 還可以用做其它的用途。,熒光素酶(luciferase, luc)報告基因　 該酶克隆于北美洲螢火蟲的熒光素酶基因,它能催化甲蟲的熒光素的氧化性羧化作用,發(fā)射出光子,能被光度計或閃爍計數(shù)器捕獲定量。 快速、方便,更具有很好的濃度線性范圍(具有7～8個數(shù)量級的線性范圍),而被廣泛應用。

38、 能在合成時與蛋白產(chǎn)生融合蛋白,該酶的檢測靈敏度達10-20 mol,且該酶的半衰期很短,在評價基因的表達物的誘導效應的瞬間分析中具有較好的效果。 在化學反應中通過降低反饋抑制而使信號更加穩(wěn)定,使其檢測可以用液閃法或光照度計法進行檢測。,綠色熒光蛋白(GFP）報告基因　 該基因來源于西北太平洋海域的水母。該蛋白在紫外光下發(fā)射熒光,而可以被多種方法檢測。該報告基因檢測不需要底物。 綠熒光蛋白在加熱

39、、變性劑、去垢劑及一般的蛋白酶均不能使它滅活?？捎脽晒怙@微鏡或熒光激活的FACS進行檢測, 能在活細胞條件下觀測,而且能進行細胞內(nèi)的定位分析。能在轉(zhuǎn)基因小鼠中以無害的形式整合于小鼠的DNA中。,報告基因的應用,啟動子活性分析基因轉(zhuǎn)移分析信號轉(zhuǎn)導通路的活性檢測受體功能鑒定細胞毒性檢測生物大分子的相互作用藥物開發(fā)的生物篩選,蛋白轉(zhuǎn)導或細胞轉(zhuǎn)導肽 (PTDs),細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導肽,◆ 概念,一些蛋白質(zhì)如HI

40、V 的TAT蛋白、果蠅轉(zhuǎn)錄因子Antp、HBV的前S抗原等可以進入細胞。其特定結(jié)構(gòu)域（一般10-30個氨基酸）對其進入細胞發(fā)揮主要作用。如果將這一結(jié)構(gòu)域可以攜帶生物大分子以非受體依賴方式進入細胞。這些具有攜帶生物大分子進入細胞的多肽統(tǒng)稱為細胞轉(zhuǎn)導肽（Transduction peptide）或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導功能區(qū)（protein transduction domain, PTD）。,,◆病毒蛋白TAT和VP22從感染細胞到非感染細胞的擴散。

41、◆蛋白轉(zhuǎn)導的可能作用機制：非受體特異性的轉(zhuǎn)導途徑。 經(jīng)典的轉(zhuǎn)導途徑：受體---運輸小體---內(nèi)涵體（或胞飲作用） 蛋白轉(zhuǎn)導：富含精氨酸和賴氨酸的蛋白結(jié)構(gòu)易于和帶負電 的磷脂膜結(jié)合。轉(zhuǎn)導的非折疊構(gòu)象進入細胞內(nèi)重新再折疊。,◆三種主要的蛋白轉(zhuǎn)導系統(tǒng)：HIV-1 TAT, HSV VP22, Antp Antp所能結(jié)合并轉(zhuǎn)導到細胞內(nèi)的蛋白大于100氨基酸； TAT, VP22可攜帶大于1000個氨基酸,蛋白

42、轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的三種產(chǎn)生途徑,■蛋白轉(zhuǎn)導系統(tǒng)中肽段的人工合成：并且與蛋白轉(zhuǎn)導結(jié) 構(gòu)域結(jié)合的肽段可交聯(lián)成大蛋白?！鲛D(zhuǎn)染TAT或VP22的表達載體于細胞中，融合蛋白在細 胞中表達，在由原始的轉(zhuǎn)染細胞分泌而進入周圍未 轉(zhuǎn)染細胞。 ■TAT融合蛋白在細菌中大量表達，分離純化后加到培 養(yǎng)液中。,TAT蛋白轉(zhuǎn)導系統(tǒng),( A )構(gòu)建原核表達載體----將表達TAT的基因片段與目的蛋白的基因片段連接,TAT融合蛋白表達載體的構(gòu)

43、建,(B) TAT融合蛋白的大規(guī)模純化 裂解并用尿素變性后分離純化出需要的融合蛋白(應用8 M 尿素或者6M的鹽酸胍能夠有效的破壞細菌的包涵體，使所需的重組融合蛋白能夠釋放).純化的融合蛋白是變性的，但是一旦轉(zhuǎn)導入細胞，在細胞內(nèi)部的HSP90等分子伴侶的作用下，就能夠正確折疊具有活性功能的蛋白.,(C) 融合蛋白表達分析 1. 構(gòu)建好的融合蛋白表達載體轉(zhuǎn)化至 BL21菌種。 2. 從轉(zhuǎn)化的平板上挑出6-12個單菌落，各自在1

44、ml的Amp抗性 LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中含有誘導 劑(IPTG)，濃度為100 μM。 3. 將菌體離心沉淀并重懸于 2×SDS 的樣品緩沖液中，通過SDS–PAGE電泳進行融合蛋白表達的分析，挑選出融合蛋白表達最多的菌種。 4. 將SDS–PAGE電泳的膠進行轉(zhuǎn)膜，應用HA標簽的抗體或者所融合目的蛋白的抗體進行Western-blotting證實融合蛋白的表達。,( D )蛋白轉(zhuǎn)導實驗以及檢測■ 應

45、用Fluorescein (FITC)等標記轉(zhuǎn)導的融合蛋白,采用熒光顯微鏡或者流式細胞儀技術(shù)可以對蛋白轉(zhuǎn)導進行檢測或分選。■ 采用免疫組化可能對 TAT融合蛋白進行定位?！?現(xiàn)在已有了TAT-GFP載體，在融合蛋白中構(gòu)建了綠色熒光蛋白，能夠?qū)Φ鞍邹D(zhuǎn)導示蹤。,蛋白轉(zhuǎn)導系統(tǒng)與基因轉(zhuǎn)染的比較（優(yōu)點）：,■ 轉(zhuǎn)導效率高：所有的真核細胞均能被蛋白轉(zhuǎn)導，包括有 壁的酵母細胞，原代培養(yǎng)的細胞和所有基因轉(zhuǎn)染和逆病 毒轉(zhuǎn)染效率低的

46、細胞?！?發(fā)生作用快，在無血清的培養(yǎng)液中15分鐘內(nèi)起效?！?可定量，細胞內(nèi)的融合蛋白濃度可嚴格控制。■ 轉(zhuǎn)導過程中宿主細胞損傷較小■ 融合蛋白還能夠轉(zhuǎn)導入活體動物的細胞和各個組織，并 具備有穿越血腦屏障的能力可轉(zhuǎn)導整個動物體。,蛋白轉(zhuǎn)導系統(tǒng)與基因轉(zhuǎn)染的比較（缺點）：,■ 可攜帶的目的蛋白15-120KDa。■ 有部分融合蛋白在細菌表達體系中產(chǎn)量低，且缺 少轉(zhuǎn)錄后修飾?！?融合蛋白的定位差?！?作用時間短，6天