蛋白質(zhì)沉淀技術

1、蛋白質(zhì)沉淀技術,一、蛋白質(zhì)的基本性質(zhì),蛋白質(zhì)是人體機能構成成分,人體任何器官和組織都是以蛋白質(zhì)作為重要組成成分。鑒于蛋白質(zhì)重要性研究蛋白質(zhì)分離十分必要。,1、膠體性質(zhì),蛋白質(zhì)表面有一些親水基團易起水合作用，從而形成水化層，導致蛋白質(zhì)顆粒不易聚集沉淀，這些蛋白質(zhì)分子直徑在2～20nm范圍，所以蛋白質(zhì)溶液是親水膠體，具有半通透性，丁達爾效應、布朗運動等一些親水膠體性質(zhì)① 。,[1] 楊豐科.系統(tǒng)有機化學[M].北京:化學工業(yè)出版社,2003

2、·433 一 435.,2、兩性解離和等電點,蛋白質(zhì)可解離基團包括末端α-氨基和末端α-羧基及可解離側(cè)鏈R基。這些可解離基團在特定的PH范圍內(nèi)解離，產(chǎn)生帶正電荷或者帶負電荷的基團。當溶液PH使蛋白質(zhì)所帶正電荷與負電荷恰好相等，即蛋白質(zhì)分子本身凈電荷為零，此時PH即為該蛋白質(zhì)分子等電點，用PI表示，測PI時一定在緩沖液中進行，因為離子強度可以使PI改變① 。,[1] 楊豐科.系統(tǒng)有機化學[M].北京:化學工業(yè)出版社,2003&#

3、183;433 一 435.,兩性解離和等電點,,3、沉淀作用,沉淀是指在溶液中加入沉淀劑使溶質(zhì)溶解度降低，形成固相從溶液中析出從而達到分離的一種技術。沉淀分離方法和其他分離方法相比，優(yōu)點是過程簡單、成本低、原料易得，便于小批量生產(chǎn)，在產(chǎn)物濃度愈高的溶液中沉淀越有利、收率越高；缺點為過濾困難、產(chǎn)品質(zhì)量較低，需重新精制。,4、變性作用,天然蛋白質(zhì)受物理或化學因素影響，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部維系其高級結(jié)構原有氫鍵、鹽鍵等次級鍵遭到破壞，使分子內(nèi)部

4、結(jié)構發(fā)生改變，導致其生物學性質(zhì)、物理化學性質(zhì)改變，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)變性作用。,5、凝固作用,變性蛋白質(zhì)分子相互凝聚或相互穿插纏繞在一起的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)凝固，例如生雞蛋蛋白溶液受熱變?yōu)榈鞍讐K現(xiàn)象。,6、顏色反應,蛋白質(zhì)顏色反應實際上是氨基酸一些基團肽鍵等與一定試劑所產(chǎn)生化學反應。,二、蛋白質(zhì)沉淀分離技術,蛋白質(zhì)膠粒上同性電荷互相排斥，不易凝聚成團下沉；蛋白質(zhì)表面許多親水基團水合作用形成一層水化膜,在膠粒之間起隔離作用，蛋白質(zhì)在水溶液中,

5、雖分子量很大,但仍能維持穩(wěn)定溶解狀態(tài)。若能除去其水化膜并中和其電荷,則蛋白質(zhì)可從溶液中沉淀而出。常用有以下幾種沉淀方法：,蛋白質(zhì)沉淀分離常用方法,1、鹽析法2、有機溶劑沉淀法3、等電點沉淀法4、變性沉淀分離技術5、復合鹽沉淀法,1、鹽析法（中性鹽沉淀）,一般來說,所有固體溶質(zhì)都可在溶液中加入中性鹽而沉淀析出,這一過程稱之鹽析②。（1）中性鹽沉淀蛋白質(zhì)的基本原理 a.高濃度鹽離子使蛋白質(zhì)表面雙電層厚度降低，靜電排斥作用減弱。

6、 b.中性鹽比蛋白質(zhì)具更強的親水性，因此將與蛋白質(zhì)爭奪水分子。,[2] 李冬梅,張錦茹,田 園.蛋白質(zhì)沉淀分離[J].糧食與油 脂,2007·9 一 11,鹽析法,鹽析機理示意圖,鹽析法,（2）中性鹽的選擇原則a.要有較強的鹽析效果。 一般來說，陰離子影響鹽析的效果比陽離子顯著，且含高價陽離子的無機鹽比含低價陽離子的無機鹽效果好。b.要有足夠大的溶解度，且溶解度受溫度影響盡可能地小。 便

7、于獲得高濃度的鹽溶液，尤其是在低溫時，不至于造成鹽結(jié)晶的析出。c.不影響蛋白質(zhì)等生物大分子的活性，并且，最好不引入給分離或測定帶來麻煩的雜質(zhì)。d.來源豐富，價格低廉。,鹽析法,常用的中性鹽有：(NH4)2SO4 ，Na2SO4 ，NaH2PO4 等。其中最重要的是(NH4)2SO4。優(yōu)點：①溶解度大 ；尤其是在低溫時仍有相當高的溶解度 ②分離效果好； ③有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構的作用，不易引起變性；

8、 ④價格便宜；廢液可以肥田，不污染環(huán)境。缺點：硫酸銨水解后變酸，在高pH值下會釋放出氨，腐蝕性 較強，因此，鹽析后要將硫酸銨從產(chǎn)品中除去。,鹽析法,（3）影響鹽析的因素,a.蛋白質(zhì)濃度,一般較適當?shù)臉悠窛舛仁?.5%-3.0%，通過實驗確定。,b.離子強度和類型,一般來說,離子強度越大,蛋白質(zhì)溶解度越低。下面為幾種鹽鹽析能力排列次序:磷酸鉀> 硫酸鈉>磷酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂③,[3] G

9、elazka V B ,Smith D D S ,Ledward D A ,et al .Influence of high pressure on protein-polysaccharide interactions[J] . Pros.Int.Conf ,1998,24:397-400.,鹽析法,c.pH值,一般來說,蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多,溶解度越大；凈電荷越少,溶解度越小,在等電點時蛋白質(zhì)溶解度最小,為提高鹽析效率,多將溶液pH

10、值調(diào)到目的蛋白等電點處。,d.溫度,在低離子強度或純水中,蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度增加而增加;但在高濃度下,蛋白質(zhì)、酶和多肚類物質(zhì)溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下,蛋白質(zhì)對鹽析溫度無特殊要求,可在室溫下進行,只有某些對溫度較敏感酶要求在0℃～4℃進行。,鹽析法,（4）脫鹽 常用的脫鹽處理方法有：透析法、超濾及凝膠過濾法。透析最早應用的膜分離技術。,2、有機溶劑沉淀法,（1）有機溶劑沉淀機理：降低水的介電常數(shù),導致具有表面水

11、層的生物大分子脫水,相互聚集,最后析出。該法優(yōu)點在于：a.分辨能力比鹽析法高,即蛋白質(zhì)只在一個較窄有機溶劑濃度下沉淀;b.沉淀不用脫鹽，過濾較為容易。其缺點是對具有生物活性大分子易引起變性失活,操作要求在低溫下進行?？傮w來說,有機溶劑沉淀法不如鹽析法普遍② 。,[2] 李冬梅,張錦茹,田 園.蛋白質(zhì)沉淀分離[J].糧食與油 脂,2007·9 一 11,有機溶劑沉淀法,(2)有機沉淀劑有機沉淀劑有乙醇、甲醇、丙酮、二

12、甲基甲酰胺、二甲基亞砜、異丙酮等, 其中最常用的是乙醇和丙酮。蛋白質(zhì)和酶的沉淀大多采用乙醇, 由于甲醇、丙酮均有一定毒性, 故使用時必須謹慎。,有機溶劑沉淀法,(3)有機沉淀劑分離技術的影響因素,,有機溶劑沉淀法,(4) 應用實例應用實例有高粱蛋白質(zhì)的提取, 其基本工藝流程為: 高梁粉→萃取→離心→沉淀→水洗→烘干[4],[4] 張偉敏,譚小蓉,鐘 耕.高粱蛋白質(zhì)研究進展[J].糧食與油脂,2005(1):7- 9.,3、等電點沉淀

13、法,（1）等電點沉淀法的原理,等電點(pI)是兩性物質(zhì)在其質(zhì)點的凈電荷為零時介質(zhì)的pH值,溶質(zhì)凈電荷為零，分子間排斥電位降低，吸引力增大，能相互聚集起來，沉淀析出，此時溶質(zhì)的溶解度最低。,等電點沉淀法,（2）等電點沉淀法的影響因素,a.雜質(zhì)種類的影響混合液中存在許多等電點相近的兩性電解質(zhì)，單獨使用此法效果差。b.離子強度的影響蛋白質(zhì)有鹽溶和鹽析兩面性，等電點的數(shù)值隨著溶液中中性鹽離子的種類和濃度變化而變化，所以離子強度對等電點的沉

14、淀作用影響較大。c.溶質(zhì)表面極性的影響等電點沉淀法適合于疏水性較大的蛋白質(zhì)（如酪蛋白），因其表面水化層相對較薄。而親水性較強的蛋白質(zhì)在等電點下不容易產(chǎn)生沉淀，這時需要結(jié)合其他方法一起使用。,等電點沉淀法,(3) 應用實例,應用實例有大豆蛋白的 堿提酸沉法, 基本工藝流程為: 豆粕原料→二次堿提→粗濾→酸沉→打漿→回調(diào)→改性→噴粉→成品[5],[5] 高孔榮, 黃惠華, 梁照為. 食品分離技術[ M ] . 廣州: 華南理工大學出版

15、社, 1998: 12- 15.,4、變性沉淀分離技術,（1）基本原理,利用生物大分子物質(zhì)對物理、化學等外部環(huán)境因子敏感性的差異而選擇性地使一種組分發(fā)生變性形成沉淀, 而另一些組分保持不變, 從而達到分離、除雜和提純的目的。,變性沉淀分離技術,（2）變性沉淀分離的方法,a.熱變性沉淀分離: 利用蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性不同的特點, 使蛋白質(zhì)組分之間得以分離, 同時使蛋白質(zhì)與水及其他可溶物分離, 此法常用于組織化植物蛋白的生產(chǎn)[6] 。,[6] 張

16、建云, 邱 堅, 李正紅,等.木豆葉蛋白提取工藝研究[J] .西南林學院學報, 2001, 21( 1) : 40- 44.,變性沉淀分離技術,b.選擇性酸堿變性沉淀分離:利用酸堿變性原理, 通過調(diào)節(jié)溶液 pH 值, 可有選擇地去除雜蛋白, 常用于生化制備中[7] 。,c.利用酶進行變性分離:利用酶的催化作用使一些蛋白質(zhì)變性, 從而沉淀分離, 如凝乳酶催化牛乳酪蛋白的沉淀。,[7] 劉 芳, 敖常偉. 刺槐葉蛋白提取工藝條件的初步研究[

17、J] . 中南林學院學報, 1999, 19( 1) : 64- 67.,變性沉淀分離技術,d.利用表面活性劑或有機溶劑引起變性沉淀分離: 在制備核酸時, 可加入含水酚、氯仿以及十二烷基磺酸鈉等試劑, 有選擇地使蛋白質(zhì)發(fā)生變性沉淀, 達到去除雜質(zhì)、提純核酸的目的。,變性沉淀分離技術,(3)影響蛋白質(zhì)變性的因素,a.溫度。在較高溫度作用下, 蛋白質(zhì)的二級、三級和四級結(jié)構的弱鍵斷裂, 破壞了肽鏈原來特有的排列和空間結(jié)構, 使原來在

18、大分子內(nèi)部的極性基團轉(zhuǎn)到分子表面, 促進蛋白質(zhì)分子相互凝集而沉淀, 但溫度過高又會使蛋白質(zhì)發(fā)生變性。,變性沉淀分離技術,b.pH值。大部分蛋白質(zhì)在 pH 4～10 的范圍內(nèi)是比較穩(wěn)定的,超過這個范圍強酸或強堿會使蛋白質(zhì)分子內(nèi)的基團帶電性質(zhì)發(fā)生變化, 從而破壞靜電引力所形成的鍵,使原來的構象發(fā)生變化, 導致蛋白質(zhì)變性c.其他化學因子。,5、鹽復合物沉淀法,a. 金屬復合鹽法:許多有機物質(zhì)包括蛋白質(zhì)在內(nèi),在堿性溶液中帶負電荷,能與金

19、屬離子形成沉淀。根據(jù)有機物與它們之間作用機制,可分為羧酸、胺及雜環(huán)等含氮化合物,如銅、鋅、鍋;親羧酸疏含氮化合物類,如鈣、鎂、鉛;親硫氫基化合物類,如汞、銀、鉛等。蛋 白質(zhì)一金屬離子復合物重要性質(zhì)是對溶液介電常數(shù)非常敏感,調(diào)整水溶液介電常數(shù)(如加入有機溶劑),即可沉淀多種蛋白。,復合鹽沉淀法,b.有機鹽法:含氮有機酸如苦味酸、苦酮酸、靴酸等能與有機分子堿性功能團形成復合物而沉淀析出。但此法常發(fā)生不可逆沉淀反應,故用于制備蛋白質(zhì)時,需采用