基于滾環(huán)DNA擴(kuò)增和納米金的生物傳感技術(shù)研究.pdf

1、近年來新的分子生物學(xué)技術(shù)不斷涌現(xiàn),并在科學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用中得到不斷的發(fā)展和完善,使生物分子檢測(cè)的靈敏度和特異性都得到很大的提高。但隨著疾病診斷水平的不斷提高和科學(xué)研究的不斷深入,對(duì)生物分子檢測(cè)方法的要求也越來越高。因此,我們迫切需要開發(fā)一些高靈敏性、高特異性、高通量性和高準(zhǔn)確性的定性或定量方法,以便更好地滿足研究和實(shí)際應(yīng)用的需要。針對(duì)上述問題,本論文在蛋白質(zhì)和核酸的分析和檢測(cè)方面發(fā)展了一系列新的高靈敏性的生物傳感技術(shù),并通過分析實(shí)際樣品

2、以及對(duì)照經(jīng)典的檢測(cè)方法,初步驗(yàn)證了這些技術(shù)的可行性、可靠性及準(zhǔn)確性。
　　 (1)核酸適體,是通過體外篩選技術(shù)從寡核苷酸庫(kù)中隨機(jī)篩選出的一段短的與特定的目標(biāo)分子具有高親和力和高特異性的寡核苷酸探針。在第2章,我們利用核酸適體可與抗體相媲美的特點(diǎn),基于滾環(huán)DNA擴(kuò)增技術(shù)(RCA),構(gòu)建了一種新型的高靈敏性的檢測(cè)蛋白質(zhì)的電化學(xué)適體傳感器,并實(shí)現(xiàn)了對(duì)模型蛋白一血小板源生長(zhǎng)因子B鏈(PDGF-BB)的高靈敏性和特異性檢測(cè)。該方法首先采用

3、巰基乙胺自組裝技術(shù)和戊二醛交聯(lián)技術(shù)將PDGF-BB抗體固定在金電極表面,然后通過抗體-抗原-核酸適體免疫夾心反應(yīng),將帶有RCA引物的PDGF-BB核酸適體連接在金電極上。該適體-引物探針在連接反應(yīng)組分和滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)組分中對(duì)環(huán)形DNA模板進(jìn)行滾環(huán)放大反應(yīng),接著利用生物素標(biāo)記的探針捕獲擴(kuò)增產(chǎn)物,再通過生物素-親和素特異性結(jié)合將堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素捕捉在金電極上,結(jié)合酶的生物催化銀沉積反應(yīng)放大分析信號(hào),實(shí)現(xiàn)對(duì)人血清中PDGF-BB的檢測(cè)

4、,動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍寬達(dá)4個(gè)數(shù)量級(jí),從10 fM到100 pM,檢測(cè)下限可達(dá)10 fM,比文獻(xiàn)所報(bào)道的高3個(gè)數(shù)量級(jí)。
　　 (2)上章構(gòu)建的核酸適體-RCA電化學(xué)免疫傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)模型蛋白PDGF-BB的高靈敏性檢測(cè),但是到目前為止,已經(jīng)篩選出的核酸適體種類有限,不能滿足大量蛋白質(zhì)檢測(cè)的需要,且核酸適體在蛋白質(zhì)表面的非特異性吸附會(huì)產(chǎn)生一定的背景干擾。第3章中,我們?cè)诖藢?shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用脂質(zhì)體包埋DNA技術(shù)和滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù),構(gòu)建了一種超靈

5、敏性的免疫分析方法用于前列腺特異性抗原(PSA)的檢測(cè)。首先將PSA抗體吸附在微孔板上,免疫夾心反應(yīng)后,將表面包被了PSA抗體,里面包埋了RCA引物的脂質(zhì)體固定在微孔板上,然后溶解脂質(zhì)體,釋放其內(nèi)包埋的RCA引物。接著加入滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)組分進(jìn)行RCA反應(yīng),隨后加入生物素標(biāo)記的探針和熒光素標(biāo)記的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交,再用親和素標(biāo)記的微珠捕獲反應(yīng)產(chǎn)物,最后檢測(cè)熒光信號(hào)。由于該方法結(jié)合了脂質(zhì)體包埋引物探針和RCA兩步放大反應(yīng),分析的靈敏度得到了顯

6、著的提高,響應(yīng)動(dòng)態(tài)范圍從0.1 fg/mL到0.1ng/mL,檢測(cè)下限為0.08 fg/mL。
　　 (3)第4章中,鑒于RCA技術(shù)的高靈敏度,結(jié)合核酸外切酶Ⅰ(ExoⅠ)末端保護(hù)技術(shù),發(fā)展了一種高靈敏性的檢測(cè)模型分析物—葉酸結(jié)合蛋白的光學(xué)生物傳感技術(shù)。該方法利用葉酸與葉酸結(jié)合蛋白的特異性結(jié)合,保護(hù)葉酸標(biāo)記的單鏈DNA不被ExoⅠ水解,作為后續(xù)RCA反應(yīng)的成環(huán)模板。當(dāng)DNA鏈完整存在時(shí),引發(fā)滾環(huán)DNA擴(kuò)增反應(yīng),隨后擴(kuò)增產(chǎn)物與Ta

7、qman探針雜交,在核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)作用下引發(fā)酶切循環(huán)放大反應(yīng),產(chǎn)生熒光信號(hào)。結(jié)果表明,該方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)葉酸結(jié)合蛋白的高靈敏性檢測(cè),響應(yīng)動(dòng)態(tài)范圍從1 pM到1 nM,檢測(cè)下限為1 pM。
　　 (4)第5章中,我們?cè)谏险履┒吮Ｗo(hù)技術(shù)的基礎(chǔ)上,基于核酸外切酶Ⅲ末端保護(hù)技術(shù)和納米金凝聚變色效應(yīng),提出了一種新型、快速、簡(jiǎn)便、靈敏的比色傳感策略用于序列特異性DNA結(jié)合蛋白的檢測(cè)。首先是包含有目標(biāo)結(jié)合蛋白的結(jié)合序列的互補(bǔ)金標(biāo)探針雜交

8、形成納米金團(tuán)聚體,溶液呈紫色。目標(biāo)結(jié)合蛋白存在時(shí),與其特定結(jié)合序列的特異性結(jié)合,保護(hù)納米金團(tuán)聚體不被ExoⅢ水解,溶液保持紫色不變。當(dāng)目標(biāo)結(jié)合蛋白不存在時(shí),ExoⅢ水解DNA雙鏈,釋放納米金團(tuán)聚體,納米金呈單顆粒分散狀態(tài),溶液變紅色。結(jié)果表明,序列特異性DNA結(jié)合蛋白在0～120 nM范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,檢測(cè)下限為10 nM。
　　 (5)第6章中,建立了一種基于納米金凝聚變色效應(yīng)的檢測(cè)T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)活性

9、的新方法。鑒于寡核苷酸鏈標(biāo)記的納米金能夠穩(wěn)定存在于一定濃度的鹽離子緩沖溶液中,利用5'羥基修飾的分子信標(biāo)作為金標(biāo)探針,有T4 PNK存在時(shí),金標(biāo)探針5'羥基磷酸化,λ核酸外切酶被激活,酶切分子信標(biāo)莖部雙鏈DNA片段,接著在RecJ核酸外切酶作用下降解納米金上修飾的殘余的單鏈DNA,使得納米金在一定鹽離子濃度下團(tuán)聚,溶液變成藍(lán)紫色。結(jié)果表明,T4 PNK激酶的檢測(cè)的線性響應(yīng)范圍為0～4 U/mL,檢測(cè)下限為0.24 U/mL。
　　

10、 (6)第7章中,提出了一種基于胞嘧啶-銀離子-胞嘧啶特定結(jié)構(gòu)(C-Ag+-C)的非標(biāo)記納米金比色傳感技術(shù)用于檢測(cè)銀離子(Ag+)。無Ag+存在時(shí),富C鏈吸附在納米金表面,增加了納米金表面的負(fù)電荷,從而增加了它們的排斥力,在一定鹽離子濃度下保護(hù)納米金不團(tuán)聚,溶液呈紅色。當(dāng)Ag+存在時(shí),富C鏈通過C-Ag+-C配對(duì)形成準(zhǔn)雙鏈結(jié)構(gòu),不能吸附在納米金表面,沒有DNA鏈保護(hù)的納米金顆粒在一定鹽離子濃度下發(fā)生團(tuán)聚,顏色由紅色變成藍(lán)色。結(jié)果表明,