基于金納米顆粒和核酸的生物傳感新方法的研究.pdf

1、納米材料由于具有量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等，表現(xiàn)出一系列獨(dú)特的力學(xué)、光學(xué)、電學(xué)、磁學(xué)及催化性能，因此，在諸多領(lǐng)域中得到日益廣泛的應(yīng)用。而在眾多納米材料中，金納米材料是各領(lǐng)域應(yīng)用得最多的納米材料之一。近年來(lái)，金納米材料在生物傳感方面的應(yīng)用也已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)及焦點(diǎn)。當(dāng)今世界，生物傳感器已經(jīng)普遍應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、臨床檢測(cè)、生物化工、食品工業(yè)以及環(huán)境檢測(cè)等方面，金納米材料由于其超強(qiáng)的吸附能力、良好的定向能力和生物兼容

2、性，為生物傳感器的研究和應(yīng)用提供了新思路。
　　DNA探針作為一種生物傳感工具，它能巧妙地利用生物分子的一些特殊的化學(xué)性質(zhì)，如核酸的雜交、蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合、酶的生化功能、立體構(gòu)象轉(zhuǎn)變等，結(jié)合分子水平的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，將相關(guān)的生命信息轉(zhuǎn)變?yōu)橐子跈z測(cè)的信號(hào)，如熒光、拉曼、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)信號(hào)等。DNA探針由于其特異性強(qiáng)、背景信號(hào)低、易于實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已成為生物傳感研究的熱點(diǎn)。本文利用金納米顆粒與DNA探針，結(jié)合本小組已發(fā)展的方

3、法和技術(shù)，發(fā)展了一系列快速、操作簡(jiǎn)單、成本低的光學(xué)及電化學(xué)分析的新方法，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)金屬離子、DNA、蛋白質(zhì)和腫瘤細(xì)胞的高選擇性、高靈敏度的檢測(cè)。其主要內(nèi)容如下:
　　(1)第2章中，我們構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單、快速、免標(biāo)記的基于DNA構(gòu)象轉(zhuǎn)換的熒光生物傳感方法用于銀離子高靈敏的檢測(cè)。我們?cè)O(shè)計(jì)了一條銀離子的特異性DNA，它是一條富含胞嘧啶C的寡核苷酸DNA，在目標(biāo)物銀離子存在的情況下，銀離子與其特異性DNA中的胞嘧啶相互作用形成C-Ag+

4、-C的復(fù)合結(jié)構(gòu)，使得銀離子特異性DNA發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)換形成發(fā)夾式的雙鏈結(jié)構(gòu)。當(dāng)我們加入熒光染料SybrGreenⅠ，它會(huì)與雙鏈DNA結(jié)合并產(chǎn)生一個(gè)增強(qiáng)的熒光信號(hào)。而相反，在不存在銀離子的情況下，銀離子的特異性DNA則不會(huì)發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)換，加入SybrGreenⅠ后，只能產(chǎn)生非常弱的熒光信號(hào)。整個(gè)的檢測(cè)過(guò)程基本上都在一步完成，并且不需要任何標(biāo)記，這就為銀離子的檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單、快速、免標(biāo)記的方法，同時(shí)也為重金屬的檢測(cè)提供了一個(gè)新的思路。

5、　　(2)第3章中，我們建立了一個(gè)基于等離激元耦合及表面增強(qiáng)拉曼散射光譜的生物傳感平臺(tái)用于DNA和Hg2+的檢測(cè)。該方法是利用未進(jìn)行修飾的金納米顆粒來(lái)進(jìn)行SERS檢測(cè):首先，單鏈DNA和雙鏈DNA在金納米顆粒表面的吸附性各不相同。單鏈DNA能夠通過(guò)強(qiáng)大的靜電吸附作用吸附在金納米顆粒表面，從而保護(hù)金納米顆粒，使其在一定鹽離子的誘導(dǎo)下不發(fā)生團(tuán)聚;但是，雙鏈DNA則沒(méi)有這一特性，在一定鹽離子的誘導(dǎo)下不能阻止金納米顆粒團(tuán)聚的發(fā)生;其次，當(dāng)單分散

6、的金納米顆粒發(fā)生團(tuán)聚時(shí)，會(huì)產(chǎn)生等離激元耦合，形成許多“拉曼熱點(diǎn)”，從而極大地增強(qiáng)了拉曼散射。我們將該傳感平臺(tái)應(yīng)用于DNA和Hg2+的檢測(cè)中，分別設(shè)計(jì)了一條與目標(biāo)DNA互補(bǔ)的DNA單鏈和一條能與Hg2+特異性結(jié)合的DNA單鏈，在目標(biāo)物存在下，目標(biāo)物與其對(duì)應(yīng)的DNA雜交或結(jié)合。當(dāng)加入金納米顆粒、拉曼報(bào)告分子和NaCl后，由于沒(méi)有單鏈DNA的保護(hù)，金納米顆粒發(fā)生團(tuán)聚，從而導(dǎo)致拉曼信號(hào)增強(qiáng)。相反，在目標(biāo)物不存在下，單鏈DNA通過(guò)強(qiáng)烈的靜電吸附作

7、用吸附在金納米顆粒表面，阻止了鹽誘導(dǎo)的金納米顆粒團(tuán)聚，從而產(chǎn)生一個(gè)弱的SERS信號(hào)。這種方法在實(shí)驗(yàn)中有著高達(dá)30倍的信噪比以及良好的選擇性，不僅設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，而且在操作上相當(dāng)快速、方便。通過(guò)利用寡核苷酸能選擇性地結(jié)合分析物這一特性，從而延伸到檢測(cè)各種分析物，例如，其他金屬離子、蛋白質(zhì)、小分子等。
　　(3)為了進(jìn)一步證明第3章中所構(gòu)建方法的普遍性，在第4章中，我們利用類(lèi)似的原理發(fā)展了一種基于目標(biāo)誘導(dǎo)的等離激元耦合的SERS方法用于牛奶

8、中三聚氰胺的檢測(cè)。我們?cè)O(shè)計(jì)了一條聚T的寡核苷酸DNA，它能通過(guò)氫鍵與三聚氰胺結(jié)合形成“T-三聚氰胺-T”的結(jié)構(gòu)，首先，通過(guò)靜電吸附作用，聚T寡核苷酸和拉曼活性染料混合吸附在金納米顆粒的表面。聚T寡核苷酸能夠保證金納米顆粒很好的分散在反應(yīng)混合溶液中，并且保護(hù)金納米顆粒在鹽離子的誘導(dǎo)下不發(fā)生團(tuán)聚。當(dāng)三聚氰胺存在時(shí)，三聚氰胺能與聚T寡核苷酸在水介質(zhì)中形成三重氫鍵，降低了金納米顆粒表面的負(fù)電荷，從而導(dǎo)致金納米顆粒的不穩(wěn)定，在加入NaCl溶液后，

9、金納米顆粒會(huì)發(fā)生團(tuán)聚。其結(jié)果是，由于金納米顆粒表面電磁場(chǎng)的顯著增強(qiáng)，粒子間強(qiáng)的表面等離激元耦合引發(fā)了明顯增強(qiáng)的拉曼信號(hào)。由于目標(biāo)物誘導(dǎo)的粒子間的等離激元耦合以及表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)增強(qiáng)的高效性，我們所發(fā)展的這種納米傳感器在三聚氰胺的快速檢測(cè)中具有很高的靈敏性和選擇性，并且在液態(tài)牛奶樣品的檢測(cè)中可達(dá)到8nM的檢測(cè)下限。
　　(4)在第5章中，利用適配體輔助靶細(xì)胞的捕獲及生物催化銀沉積反應(yīng)，構(gòu)建了一種新穎的電化學(xué)生物傳感平臺(tái)用于高靈敏地檢

10、測(cè)腫瘤細(xì)胞。本章中，我們選擇Ramos細(xì)胞做為目標(biāo)腫瘤細(xì)胞，并且我們?cè)O(shè)計(jì)了兩條不同的Ramos細(xì)胞核酸適體探針。核酸適體探針1在5'末端共價(jià)標(biāo)記了巰基基團(tuán)，它能與金面形成Au-S鍵，從而將探針1固定在金電極表面;核酸適體探針2則在5'末端標(biāo)記了一個(gè)生物素，用來(lái)結(jié)合SA-ALP并在電極表面產(chǎn)生催化銀沉積反應(yīng)。首先，將巰基標(biāo)記的捕獲探針1固定在金電極表面，用來(lái)識(shí)別、特異性捕獲目標(biāo)Ramos細(xì)胞。接著，引入探針2，與電極表面的Ramos細(xì)胞進(jìn)

11、行特異性結(jié)合，并形成“核酸適體-細(xì)胞-核酸適體”復(fù)合物。由于探針2是有生物素標(biāo)記的，因此，它能通過(guò)生物素和親和素的相互作用與SA-ALP酶結(jié)合，并在電極表面發(fā)生酶催化銀沉積反應(yīng)。最后，采用線性掃描伏安法(LSV)檢測(cè)Ag的電化學(xué)信號(hào)，從而計(jì)算出Ramos細(xì)胞的濃度。
　　該方法有很高的選擇性，具有很寬的線性檢測(cè)范圍（10～106個(gè)Ramos細(xì)胞），最低能檢測(cè)到10個(gè)Ramos細(xì)胞，并且具有相當(dāng)理想的重現(xiàn)性。該技術(shù)平臺(tái)具有優(yōu)良兼容性

12、并且符合成本效益的小型化技術(shù)，這些特性使得該方法在臨床上具有應(yīng)用潛力。此外，在為每種細(xì)胞選擇與之特定的核酸適體后，可以實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞的多元檢測(cè)。鑒于這些優(yōu)點(diǎn)，這種新穎的電化學(xué)細(xì)胞檢測(cè)方法預(yù)計(jì)將會(huì)為腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)和相關(guān)研究提供一個(gè)具有高特異性和高靈敏度的平臺(tái)。
　　(5)在第6章中，我們構(gòu)建了一種新型的基于金納米顆粒和端粒酶擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)信號(hào)的雙重放大，并結(jié)合銀沉積增強(qiáng)的電化學(xué)免疫檢測(cè)平臺(tái)用于蛋白質(zhì)的檢測(cè)。本章，我們選擇人的IgG做為靶蛋

13、白，并引入了Ab-AuNPs-P1納米復(fù)合物，這是一種在金納米顆粒上同時(shí)修飾了羊抗人IgG二抗和巰基標(biāo)記的DNA探針1(P1)的復(fù)合物，其中巰基標(biāo)記的P1鏈為端粒酶的引物鏈，是用來(lái)進(jìn)行端粒酶擴(kuò)增反應(yīng)的。首先，在金電極表面自組裝上半胱胺，通過(guò)戊二醛的交聯(lián)將羊抗人IgG抗體固定在金電極表面，用來(lái)捕獲樣品溶液中人的IgG抗原。接著，與Ab-AuNPs-P1納米復(fù)合物在電極上發(fā)生免疫夾心反應(yīng)，當(dāng)加入端粒酶及混合dNTP后，Ab-AuNPs-P1

14、納米復(fù)合物上的端粒酶引物發(fā)生端粒酶擴(kuò)增反應(yīng);然后，將生物素標(biāo)記的檢測(cè)探針2(P2)與擴(kuò)增后的重復(fù)單元進(jìn)行雜交，通過(guò)生物素與親和素的相互作用，SA-ALP酶與P2鏈結(jié)合。在SA-ALP酶的作用下，在電極表面發(fā)生酶催化銀沉積反應(yīng)。最后，采用線性掃描伏安法(LSV)檢測(cè)Ag的電化學(xué)信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)人的IgG的檢測(cè)。
　　該方法檢測(cè)目標(biāo)IgG抗原有著高達(dá)35倍的信噪比，檢測(cè)下限為0.02μg/mL。該電化學(xué)免疫傳感平臺(tái)經(jīng)過(guò)金納米顆粒及端粒