基于核酸識(shí)別的酶活性生物傳感新方法研究.pdf

1、酶作為一種具有生物催化功能的生物大分子，廣泛存在動(dòng)植物體內(nèi)，支配著生物體的新陳代謝過程，維持機(jī)體正常功能。它不僅與生物的生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳及神經(jīng)傳導(dǎo)等生命活動(dòng)息息相關(guān)，還與細(xì)胞損傷、衰老及各種癌癥等疾病的發(fā)生有關(guān)。近幾十年來，酶活性的研究得到越來越多的關(guān)注，人們不但探索了生物體內(nèi)各種酶與DNA的作用機(jī)理，還研究了一系列測(cè)定酶的活性的方法，這為進(jìn)一步研究酶的相關(guān)性能帶來了新的曙光，在生物學(xué)上具有重大的意義。生物傳感器的研究作為近年來分析化學(xué)的

2、重要課題之一，已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。其中利用DNA分子之間堿基互補(bǔ)配對(duì)的特異性而構(gòu)筑的各類以核酸作為分子識(shí)別元件的核酸生物傳感器吸引了人們的關(guān)注。由于其具有簡(jiǎn)便快速，靈敏度高，穩(wěn)定性強(qiáng)，生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛的應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。本論文主要建立了幾種簡(jiǎn)便快速、低成本、靈敏選擇性檢測(cè)Argonaute2(Ago2)蛋白的的RNA核酸內(nèi)切酶的活性及尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性的新方法。
　　論文總共分為四個(gè)部分:

3、
　　1、第一部分首先系統(tǒng)的介紹了生物傳感器的基本結(jié)構(gòu)、檢測(cè)原理、分類及應(yīng)用領(lǐng)域與前景。介紹了DNA生物傳感器的工作原理、類型及應(yīng)用，并重點(diǎn)介紹了電化學(xué)DNA生物傳感器和熒光DNA生物傳感器。然后介紹了納米材料氧化石墨烯(GO)、特殊的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)G-四鏈體及核酸切口內(nèi)切酶。最后，簡(jiǎn)要的概述了Ago2蛋白的概念及UDG的相關(guān)內(nèi)容。
　　2、第二部分基于GO建立了一種新穎的熒光信號(hào)放大傳感方法檢測(cè)哺乳動(dòng)物Ago2蛋白的RNA

4、核酸內(nèi)切酶活性。Ago2蛋白能夠與miRNA形成復(fù)合物而表現(xiàn)出RNA核酸內(nèi)切酶的活性。充分利用GO所具有的高的熒光猝滅效果及對(duì)含有不同堿基數(shù)目的單鏈DNA（ssDNA）的親和力的不同的特性，體系中標(biāo)記有熒光基團(tuán)(FAM)的DNA探針分子表現(xiàn)出很弱的背景熒光信號(hào)，而當(dāng)加入Ago2-miRNA復(fù)合物后引起目標(biāo)mRNA的斷裂并且釋放出連接有FAM的短寡核苷酸片段，F(xiàn)AM基團(tuán)遠(yuǎn)離GO表面，使得熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。而Ago2-miRNA復(fù)合物又可從

5、雜交鏈中釋放出來進(jìn)而引發(fā)下一個(gè)循環(huán)切割反應(yīng)，熒光信號(hào)得以放大。該檢測(cè)Ago2蛋白R(shí)NA核酸內(nèi)切酶活性的檢測(cè)方法具有出高靈敏度、新穎簡(jiǎn)單、低成本等優(yōu)點(diǎn)，其檢測(cè)限為1.7nM。
　　3、第三部分利用亞甲基藍(lán)(MB)作為電化學(xué)雜交指示劑，基于UDG催化移除尿嘧啶堿基誘導(dǎo)鏈釋放，建立了一種免標(biāo)記電化學(xué)傳感平臺(tái)靈敏檢測(cè)UDG活性的新方法。利用DNA分子間的雜交識(shí)別過程將含有四個(gè)尿嘧啶堿基的DNA鏈自組裝到通過電沉積樹枝狀納米金修飾的電極表面

6、，經(jīng)MB嵌插產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。當(dāng)加入U(xiǎn)DG后，尿嘧啶堿基被特異性的水解，使得DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，并且從電極表面釋放出嵌插在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的MB，使得相應(yīng)的氧化還原電信號(hào)顯著降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該傳感體系對(duì)UDG的線性響應(yīng)范圍為0.025U/mL到2U/mL，檢測(cè)限為0.012U/mL。此方法具有高靈敏、高選擇性及低成本等優(yōu)點(diǎn)。另外，該方法首次將電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)用于檢測(cè)UDG的活性。
　　4、第四部分基于核酸切口內(nèi)切酶輔助信號(hào)放大

7、策略，建立了一種免標(biāo)記均相可視化檢測(cè)堿基切除修復(fù)酶活性的新方法。以作為模型，引入含有尿嘧啶堿基的發(fā)卡DNA探針1(HP1)和富含有鳥嘌呤(G)堿基DNAzyme序列及切口酶切割序列的發(fā)卡探針2(HP2)。當(dāng)加入U(xiǎn)DG后，水解HP1鏈中的尿嘧啶堿基，引發(fā)后面一系列的反應(yīng)，并結(jié)合切口酶的作用引起循環(huán)反應(yīng)過程，最終形成大量的具有模擬HRP活性的G-四鏈體-heminDNAzyme，用于催化過氧化氫/ABTS體系產(chǎn)生顏色變化，實(shí)現(xiàn)了可視化UDG