基于DNA模板化銅納米簇的生物傳感新方法研究.pdf

1、金屬納米簇由于其獨(dú)特的性能如生物相容性、低毒性、發(fā)射波長可調(diào)、光穩(wěn)定性以及高量子產(chǎn)率等，越來越多的受到科研工作者的青睞。目前，金屬納米簇主要以牛血清蛋白蛋白、還原性物質(zhì)、樹枝狀大分子、微生物細(xì)胞等為模板來合成，而寡核苷酸鏈由于其特有的分子識別、自組裝性能以及優(yōu)良的納米尺寸效應(yīng)等特點(diǎn)，也是一種優(yōu)良的金屬納米簇的模板。以寡核苷酸鏈為模板的銅納米簇由于其制備方法簡單、成本低、生物相容性好、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，而受到人們的廣泛關(guān)注，但其應(yīng)用仍然處在

2、初級階段，因此銅納米簇還有很大的發(fā)展空間和廣闊的應(yīng)用前景。本論文主要以DNA為模板合成的銅納米簇為出發(fā)點(diǎn)，開展了一系列的研究工作。主要研究思路如下：
　　首先，基于三磷酸腺苷（ATP）與其適配體特異性識別的作用，結(jié)合富T堿基為模板的熒光銅納米簇的聚集熒光增強(qiáng)效應(yīng)，我們設(shè)計了一種免標(biāo)高靈敏檢測ATP的新方法。本方法中，我們用富T堿基序列將兩段被裂分開的ATP適配體進(jìn)行延伸，當(dāng)有ATP存在的情況下，ATP與其適配體結(jié)合形成適配體1-A

3、TP-適配體2的復(fù)合物，從而將兩段可以作為銅納米簇模板的富T堿基序列拉近，而富T堿基序列能作為模板合成銅納米簇，同時產(chǎn)生明顯的熒光增強(qiáng)效應(yīng)，且體系的熒光強(qiáng)度隨著 ATP濃度的增加而增強(qiáng)。基于此，本文建立了一種操作簡單、選擇性高、成本低的高靈敏檢測ATP的方法，線性范圍為100 nM-100μM，檢測限為10.29 nM。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜生物體系中ATP的檢測，為ATP在分子生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)診斷中提供了一種新型的檢測方法。

4、r>　　其次，基于以發(fā)夾狀富T堿基為模板的銅納米簇，我們發(fā)展了一種“turn-off”型免標(biāo)檢測T4多聚核苷酸激酶的新方法。少于15個T堿基的DNA序列不能被用作銅納米簇合成的模板，除非其位于發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的環(huán)狀區(qū)域。T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）將DNA的5端磷酸化，基于此，結(jié)合λ核酸外切酶對5端為磷酸基團(tuán)的雙鏈 DNA的識別及消解作用，我們提出了一種簡單快速的檢測 T4 PNK的新方法。在沒有T4 PNK存在的情況下，λ核酸外切酶不

5、能消解5端為羥基的發(fā)夾狀探針，因此能夠形成熒光銅納米簇。當(dāng)有T4 PNK存在的情況下，發(fā)夾狀探針的5端羥基被磷酸化，并被λ核酸外切酶識別消解，發(fā)夾狀的DNA探針被打開形成直鏈狀的DNA，因此不能有效的合成銅納米簇，體系的熒光信號大大降低。基于此，本文建立了一種簡單易行，綠色環(huán)保，成本低廉的檢測T4 PNK的方法，線性范圍是0.1-20 U/mL，檢測限為0.1 U/mL。與文獻(xiàn)報道的方法具有一定的可比性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和臨床診斷領(lǐng)域有很

6、大的應(yīng)用前景。
　　最后，基于雙鏈DNA模板化的銅納米簇為檢測信號，我們設(shè)計了一個“turn-on”型的檢測T4多聚核苷酸激酶和其抑制劑的新方法。該方法中，我們設(shè)計了一個5端突出，3端凹陷并被磷酸化的發(fā)夾狀探針，一旦發(fā)夾狀探針3端的磷酸基團(tuán)被T4多聚核苷酸激酶（T4 PNKP）水解為羥基，就能夠在Klenow Fragment（KF）聚合酶的聚合作用下，延伸生成雙鏈DNA，并作為銅納米簇的模板合成熒光銅納米簇?；诖?，本文實(shí)現(xiàn)了對