基于脫氧核酶和蛋白質(zhì)-DNA相互作用的生物傳感新方法研究.pdf

1、隨著生物科學(xué)的發(fā)展以及人類日益增長(zhǎng)的健康需求，分析化學(xué)新方法和新技術(shù)在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用正受到了前所未有的關(guān)注。生物傳感器是利用生物材料特異識(shí)別功能構(gòu)建的分析工具或系統(tǒng)，作為分析化學(xué)發(fā)展的前沿，它已被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)分析、臨床診斷、環(huán)境檢測(cè)、藥物篩選、軍事科學(xué)等相關(guān)分析領(lǐng)域。在實(shí)際應(yīng)用中，生物傳感器靈敏度高、選擇性好、成本低，并能實(shí)現(xiàn)快速地、實(shí)時(shí)的連續(xù)分析。因此，發(fā)展新的生物傳感技術(shù)或方法對(duì)于進(jìn)一步推動(dòng)相關(guān)學(xué)科領(lǐng)域的深入研究具有重

2、要的科學(xué)意義。在生物傳感新方法的研究中，脫氧核酶和蛋白質(zhì)-DNA相互作用的應(yīng)用為構(gòu)建方便的、非標(biāo)記、通用的生物分析平臺(tái)提供了新的設(shè)計(jì)思路。本論文以幾種重要的生物功能蛋白、酶及生物小分子作為分析目標(biāo)，聚焦于發(fā)展簡(jiǎn)單、低成本、高靈敏度及高選擇性的生物傳感新方法。通過(guò)利用G-四聚體脫氧核酶的高效催化能力和蛋白質(zhì)-DNA的特異識(shí)別作用，新方法研究獲得了預(yù)期的結(jié)果。本論文的第2-4章是基于G-四聚體脫氧核酶構(gòu)建的比色分析方法，第5-6章是基于蛋白

3、質(zhì)-DNA的特異識(shí)別作用構(gòu)建的生物發(fā)光和電化學(xué)分析方法，具體內(nèi)容如下：
　　T4多聚核苷酸激酶(PNK)在許多細(xì)胞內(nèi)生化進(jìn)程中起關(guān)鍵作用。在第2章中，發(fā)展了一種新的比色分析策略用于評(píng)估PNK的活性和篩選它的抑制劑，該策略利用λ核酸外切酶的高效剪切作用和G-四聚體脫氧核酶類過(guò)氧化物酶的信號(hào)擴(kuò)增作用而設(shè)計(jì)。一個(gè)包含G-四聚體脫氧核酶序列的非標(biāo)記發(fā)夾DNA被用于該分析。當(dāng)PNK存在時(shí)，該發(fā)夾DNA的5′端羥基能被磷酸化，而磷酸化的末端能

4、被λ核酸外切酶識(shí)別并剪切。由于用于“封閉”作用的互補(bǔ)序列被酶切移除，G-四聚體脫氧核酶序列得以釋放。應(yīng)用該策略，對(duì)PNK的活性分析能轉(zhuǎn)化為對(duì)G-四聚體脫氧核酶的定量分析?；诨パa(bǔ)序列的完全封閉和剪切對(duì)脫氧核酶序列的充分釋放作用，該比色方法展現(xiàn)了對(duì)PNK分析的優(yōu)異檢測(cè)能力，具備低的檢測(cè)下限（0.06 U/mL）和寬的檢測(cè)線性范圍（0.06-100 U/mL）。此外，抑制劑對(duì)PNK活性的影響也被評(píng)估。該策略有很大潛力應(yīng)用于發(fā)展高通量磷酸化分

5、析和篩選相關(guān)的藥物研究中。
　　目前已有檢測(cè)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或其他輔酶的方法通常是復(fù)雜難處理的和靈敏度一般的。在第3章中，發(fā)展了一種新的基于脫氧核酶的可視分析策略用于檢測(cè)NAD+，該策略基于連接酶介導(dǎo)的對(duì)鏈置換擴(kuò)增(SDA)的抑制作用而設(shè)計(jì)。當(dāng)存在NAD+時(shí)，SDA反應(yīng)能被抑制，由于連接后的引物不能繼續(xù)引導(dǎo)SDA，使得G-四聚體脫氧核酶序列不能被生成。這個(gè)結(jié)果引致能被G-四聚體脫氧核酶定量催化的有色產(chǎn)物不能形成。因

6、此,可實(shí)現(xiàn)對(duì)NAD+的可視、高靈敏度的定量分析。該策略提供了一個(gè)簡(jiǎn)單的、高選擇性的方法，檢測(cè)限低至50 pM。同時(shí)，它能為研究輔酶和其他小分子及DNA連接酶活性的定量檢測(cè)提供了一個(gè)通用的分析平臺(tái)。
　　最近的研究對(duì)于篩選能與多聚脫氧腺苷酸[poly(dA)]特異結(jié)合的藥物顯示了巨大興趣。在第4章中，我們發(fā)展了一個(gè)簡(jiǎn)單的比色分析策略用于檢測(cè)能與poly(dA)序列特異結(jié)合的抗腫瘤活性物質(zhì)甲氧檗因，該策略基于目標(biāo)誘導(dǎo)分裂G-四聚體DN

7、A的形成而設(shè)計(jì)。兩條包含分裂G-四聚體序列和富A序列的DNA被應(yīng)用于本策略。當(dāng)存在甲氧檗因時(shí)，都包含有富A序列的兩條DNA被拉近靠攏，形成了可催化有色化合物產(chǎn)生的G-四聚體脫氧核酶。該策略分析甲氧檗因的檢測(cè)線性范圍為0.033-1.667μM，檢測(cè)限為16 nM。該分析策略不僅操作簡(jiǎn)單，成本低廉，而且是肉眼可分辨的，在藥物篩選研究中具有很好的應(yīng)用潛力。
　　DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MTase)是一種重要生化進(jìn)程的調(diào)控因子。目前已有分析D

8、NA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的方法的通用性和靈敏度仍待改善。在第5章中，發(fā)展了一個(gè)新的生物發(fā)光分析方法用于檢測(cè)甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，該策略基于甲基化敏感的剪切和蛋白質(zhì)體外表達(dá)作用而設(shè)計(jì)。在該策略中，Dam MTase被用做檢測(cè)模型酶，MboI被用作甲基化敏感剪切的核酸外切酶。包含有熒光素酶報(bào)告基因的DNA(LR-DNA)被用于本分析。由于完全甲基化的LR-DNA能被表達(dá)成可檢測(cè)的熒光素酶，Dam MTase活性能通過(guò)檢測(cè)表達(dá)得到的熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度而

9、獲得定量。該策略對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶的檢測(cè)限低至0.08U/mL，檢測(cè)線性范圍寬達(dá)0.2-100U/mL。此外，該分析模型具有良好的通用性，可能延伸應(yīng)用于檢測(cè)其它DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和相應(yīng)的抑制劑的篩選。
　　靈敏地檢測(cè)特異DNA序列結(jié)合蛋白對(duì)于轉(zhuǎn)錄相關(guān)疾病的診斷及相應(yīng)調(diào)控機(jī)理的理解具有重要意義。在第6章中，發(fā)展了一種簡(jiǎn)單、靈敏、特異性高的電化學(xué)分析策略用于人TATA結(jié)合蛋白（TBP）的定量檢測(cè)。在該策略設(shè)計(jì)了一個(gè)包含特異TATA盒的雙鏈DN