基于DNA自組裝技術(shù)的microRNA傳感新方法研究.pdf

1、MicroRNAs（miRNAs）參與細胞生長的一系列重要進程，包括細胞增殖、分化、凋亡及死亡等過程。miRNAs表達失調(diào)將導(dǎo)致細胞的過度生長、增殖及分化，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此，其作為一種潛在的新型核酸類腫瘤標志物和潛在的治療靶點具有廣闊的臨床應(yīng)用前景?，F(xiàn)有miRNA檢測方法主要有RT-PCR，微陣列芯片及Northern blot等，雖然這些方法都有一定的優(yōu)勢，但也存在一些不足，如操作繁瑣，費時費力、靈敏度低等，這些都會在很大

2、程度上影響其臨床實用性。因此，發(fā)展簡單、實用、快速、靈敏的 miRNAs檢測技術(shù)對于闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制，尋找新的腫瘤標志物，腫瘤的早期診斷和治療，探尋新的腫瘤治療靶點具有重要價值；有助于實現(xiàn) miRNAs標志物在腫瘤臨床診療中的應(yīng)用。本論文整合分子生物學(xué)、臨床檢驗診斷學(xué)及生物分析化學(xué)等學(xué)科的最新研究成果，基于功能核酸、DNA自組裝和等溫擴增技術(shù)等，構(gòu)建兩種新穎、簡單、快速的 miRNAs傳感檢測新方法，為腫瘤標志物的早期診斷與治療提

3、供潛在的檢測平臺。本研究主要包括以下兩個部分：
　　1.核酸信號放大策略用于miRNA的比色傳感
　　整合鏈替代聚合反應(yīng)和啞鈴狀密封探針介導(dǎo)的滾環(huán)擴增雙重信號放大策略，本研究構(gòu)建了一個快速、免標記的比色傳感器用于miRNA的高靈敏、高特異性檢測。該傳感器主要包括4個組成部分，分別是由trigger模板、C-rich DNA修飾的MB，啞鈴狀滾環(huán)模板，剪切酶以及聚合酶。靶miRNA引發(fā)鏈替代聚合反應(yīng)，釋放滾環(huán)模板引物以啟動基于

4、toehold的滾環(huán)擴增反應(yīng)，從而擴增出大量富G的DNA（GDNA）序列；GDNA序列與Hemin結(jié)合形成DNAzyme催化ABTS2-和H2O2進行比色反應(yīng)，從而實現(xiàn)對 miRNAs的高靈敏、高特異性檢測。該方法檢測限低至10 aM，檢測線性范圍為10 aM~1 nM，能很好的應(yīng)用于實際樣本的檢測。本章所構(gòu)建的miRNA超靈敏檢測方法簡單、實用，有望成為腫瘤相關(guān)核酸標志物的篩選、臨床診斷應(yīng)用的有力工具。
　　2.新型DNA納米鑷

5、的設(shè)計及其多組份miRNA的同時化學(xué)發(fā)光檢測
　　本方法構(gòu)建了一種基于靶物質(zhì)誘導(dǎo)納米結(jié)構(gòu)變化的新型 DNA納米鑷，通過結(jié)合催化莖環(huán)自組裝（CHA）和鄰位觸及形成辣根過氧化物酶模擬酶（DNAzyme），實現(xiàn)了AND邏輯門操作和對多組份miRNA的同時檢測。本研究構(gòu)建的基于DX（DNA double crossover, DX）模塊的DNA納米鑷的包含有信號輸入和信號輸出結(jié)構(gòu)，兩臂中間含弓形結(jié)構(gòu)的DNA雙股螺旋作為信號輸入的識別域，用

6、于同時特異性甄別兩種不同的靶物質(zhì)；兩臂末端的拆分富G序列用于信號輸出。利用CHA信號放大策略，少量的靶物質(zhì)輸入可以靶向誘導(dǎo)大量的DNA納米鑷有打開狀態(tài)轉(zhuǎn)向閉合狀態(tài)，在Hemin存在時，鑷兩臂末端的拆分富G序列在鄰位觸及作用下形成大量 DNAzyme，從而產(chǎn)生放大的傳感輸出信號。兩種靶物質(zhì)通過AND邏輯門誘導(dǎo)調(diào)控DNA納米鑷的開關(guān)，通過聚丙烯酰胺電泳（PAGE）、表面等離子體共振（SPR）表征了該調(diào)控機制，證實新型DNA納米鑷構(gòu)建成功。構(gòu)