基于納米材料和滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的生物傳感新方法的研究.pdf

1、酶、核酸及生物小分子等的活動(dòng)在生命體中發(fā)揮著不可替代的作用，因此，快速、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)的獲取這些生命活動(dòng)信息對(duì)于生命體的研究以及疾病的臨床診斷和治療具有巨大的意義，生物傳感技術(shù)為這一需求提供了有力的手段。近年來(lái)，納米技術(shù)和核酸擴(kuò)增技術(shù)等的發(fā)展為構(gòu)建高靈敏度、高選擇性、快速高效的生物傳感器提供了全新的平臺(tái)，使生物傳感技術(shù)得到更廣泛的應(yīng)用。本論文以microRNA、DNA甲基化修飾以及組蛋白去乙?；笧檠芯繉?duì)象，結(jié)合納米材料和滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)發(fā)展了

2、一系列新型的生物傳感器。具體內(nèi)容包括:
　　microRNA在免疫細(xì)胞的分化發(fā)育、免疫應(yīng)答的調(diào)控以及免疫系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，因此，研究單個(gè)細(xì)胞中microRNA的空間分布和表達(dá)水平對(duì)于考察microRNA及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性在生物學(xué)中的作用具有十分重要的意義。在第2章中，我們開(kāi)發(fā)了一種基于目標(biāo)物觸發(fā)的等溫滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)原位檢測(cè)腫瘤細(xì)胞microRNA的新方法。該方法首先利用改良的microRNA固定方法，將mi

3、croRNA的5'端磷酸基團(tuán)與細(xì)胞中蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)EDC共價(jià)交聯(lián)，以降低microRNA在檢測(cè)過(guò)程中的損失。隨后以預(yù)先制備的DNA環(huán)探針與microRNA進(jìn)行原位雜交，具有游離的3'末端的microRNA可以自身作為引物引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，在聚合酶的作用下產(chǎn)生與DNA環(huán)探針互補(bǔ)的含有microRNA序列的串聯(lián)重復(fù)序列。最后，利用熒光檢測(cè)探針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行識(shí)別，即可達(dá)到高靈敏度、高選擇性的檢測(cè)microRNA的目的。由于滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)只能由

4、microRNA游離的3'末端觸發(fā)，因此從根本上消除了mRNA以及microRNA前體的干擾。我們使用這種方法實(shí)現(xiàn)了人肝癌細(xì)胞SMMC-7721和人正常細(xì)胞L02中miR-222與miR-223表達(dá)水平的高靈敏可視化檢測(cè)，并進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了單個(gè)細(xì)胞中不同microRNA的同時(shí)檢測(cè)。
　　DNA甲基化是表觀遺傳修飾的一個(gè)重要組成部分，其可通過(guò)影響DNA構(gòu)象、穩(wěn)定性以及與蛋白質(zhì)相互作用方式等途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，目前已成為多種腫瘤診斷

5、的生物標(biāo)志物。在第3章中，我們將滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)與DNA為模板合成銀納米簇相結(jié)合，發(fā)展了一種可進(jìn)行多組分DNA甲基化檢測(cè)的方法。該方法首先將DNA經(jīng)過(guò)亞硫酸鹽處理產(chǎn)生堿基差異后與掛鎖探針雜交，再利用E.coliDNA連接酶對(duì)錯(cuò)配堿基的高特異性識(shí)別使與帶有甲基化修飾的目標(biāo)DNA完全互補(bǔ)的掛鎖探針連接成環(huán)形。隨后，以銀納米簇DNA模板作為引物，在具有強(qiáng)鏈置換能力的DNA聚合酶作用下啟動(dòng)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生環(huán)形探針的重復(fù)互補(bǔ)串聯(lián)序列。另外，擴(kuò)增產(chǎn)物

6、的莖桿區(qū)域帶有HhaI內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，可在酶的作用下釋放出大量可以合成銀納米簇的DNA模板。在硝酸銀、硼氫化鈉的作用下，產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA甲基化的檢測(cè)。該方法設(shè)計(jì)巧妙新穎，具有很好的靈敏度和選擇性，檢測(cè)限達(dá)6.4fM。
　　組蛋白去乙酰化酶參與了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖與表達(dá)調(diào)控等諸多過(guò)程，且在癌細(xì)胞中高表達(dá)，使組蛋白處于低乙?；臓顟B(tài)，抑制多種抑癌蛋白及凋亡分化相關(guān)基因的表達(dá)，目前已成為腫瘤治療的靶點(diǎn)而日益引起學(xué)術(shù)界的

7、重視。在第4章中，我們以組蛋白去乙?；?為模型分析對(duì)象，建立了一種基于氧化石墨烯平臺(tái)的組蛋白去乙?；笝z測(cè)新方法。在該方法中，使用了具有兩部分功能的多肽序列，一部分序列能夠通過(guò)π-π堆積作用吸附在氧化石墨烯表面，使氧化石墨烯與熒光基團(tuán)之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移從而淬滅熒光基團(tuán)的熒光;另一部分序列則包含熒光基團(tuán)及組蛋白去乙酰化酶作用的賴(lài)氨酸乙?；稽c(diǎn)。利用胰蛋白酶對(duì)組蛋白去乙?；缸饔煤蟮馁?lài)氨酸進(jìn)行識(shí)別和切割，可使熒光基團(tuán)游離，從而避免被